医学论文：CEUS技术在创伤性周围神经损伤不同时期的医用价值

　　摘    要：　目的 评估超声造影(CEUS)在周围神经挤压伤检测中的应用价值。方法 采用随机数字表法将30只新西兰白兔随机分为正常对照组,坐骨神经挤压伤术后3d,2、4、8周组,每组6只。采用常规高频超声、超声能量多普勒成像(PDUS)、CEUS及组织病理学共同检测受损坐骨神经组织内部的形态结构及血流灌注情况。结果 常规超声结果显示,术后8周的神经内径与正常对照组差异无统计学意义[(1.14±0.15)mm比(0.92±0.11)mm;t=4.72,P=0.86]。对神经血流灌注的分析显示,PDUS在神经损伤后急性期(术后3d)敏感度较高,可显示损伤神经内部的细微血流信号,但在术后4、8周显示血流欠佳。CEUS可清晰显示神经损伤后3d及2、4、8周的微循环灌注情况,并通过时间-强度曲线下面积、达峰时间和峰值强度定量发现术后3d挤压伤处神经血流灌注显着增多,而后随时间变化逐渐减少。组织病理学检查结果显示,术后8周的中位累积OD值为12 035.6(10 566.3,14 805.8),仍明显低于正常对照组的18 784.8(15 904.5,21 103.5)(H=6.10,P=0.0003)。结论 常规超声及PDUS难以充分评估神经损伤后不同时期的微循环灌注。CEUS可在损伤神经的任何时期对其内部微血流灌注情况进行定量评估,为间接评估神经再生情况提供更多的信息。

　　关键词：　坐骨神经; 周围神经损伤; 超声检查; 超声能量多普勒成像; 超声造影技术;

　　Abstract：　Objective To explore the value of contrast-enhanced ultrasound(CEUS)in the detection of peripheral nerve crush injury.Methods Thirty New Zealand white rabbits were randomly divided into normal control group and sciatic nerve crush injury group(which included 3-day,2-week,4-week,and 8-week groups after operation).The morphological structure and blood perfusion of the injured sciatic nerves were detected by high-frequency ultrasound,power Doppler ultrasound(PDUS),CEUS,and histopathology.Results Conventional ultrasound revealed that the internal diameter of nerves showed no significant difference between the 8-week group and the control group [(1.14±0.15)mm vs.(0.92±0.11)mm;t=4.72,P=0.86].Analysis of nerve blood perfusion showed that PDUS had a high sensitivity in displaying fine blood flow signal inside the injured nerve in the acute stage of inflammation(3-day group)but not good enough in the 4-and 8-week groups.CEUS could clearly show the microcirculation perfusion in the 3-day,2-week,4-week,and 8-week groups,and analyses of the area under the curve,the peak time,and the peak intensity showed that the nerve blood perfusion increased significantly 3 days after operation and then decreased gradually.Histopathological examination showed that the median cumulative OD value was 12 035.6(10 566.3,14 805.8)8 weeks after operation,which was still significantly lower than that 18 784.8(15 904.5,21 103.5)in the normal control group(H=6.10, P=0.0003).Conclusions Conventional high-frequency ultrasound and PDUS can not adequately evaluate the microcirculation perfusion in different periods after nerve injury.CEUS can quantitatively evaluate the microvascular perfusion of injured nerve at any period and provide more information for indirect evaluation of nerve regeneration.

　　Keyword：　sciatic nerve; peripheral nerve injury; ultrasonography; power doppler ultrasound; contrast enhanced ultrasound;

　　创伤性周围神经损伤(peripheral nerve injury,PNI)是致残的常见原因,可造成肢体的感觉、功能障碍,不仅降低生活质量,危害患者的身心健康,严重者甚至会加重社会负担[1]。神经电生理检测对病变部位的识别及神经损伤病因的判定具有局限性[2]。高频超声评估周围神经损伤越来越受到临床医生的重视,不仅可提供较高的空间分辨率,还可准确定位神经病变的部位、回声及与周围组织的关系[3]。然而,常规高频超声检查因无法评估神经内及周围组织的微循环情况,其临床应用受到限制。文献报道,神经损伤后神经内微血管断裂,如若未能及时干预治疗,将持续损伤神经内部血液循环,抑制轴突再生[4]。因此,需要进一步结合其他检查方法更为全面地评估神经损伤情况。
 

　　能量多普勒成像(power Doppler ultrasound,PDUS)技术是检测炎性病变血流的常用方法,与彩色多普勒血流显像相比,不受血流角度的影响,对低速血流的显示率更高。研究显示,PDUS在评估类风湿性关节炎疾病的活动性方面比临床实验室相关指标的敏感性更高[5]。超声造影技术(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)可获得低噪声的实时谐波图像,显示微血管血流。研究发现,通过CEUS对时间-强度曲线下面积(area under the curve,AUC)检测,腕管综合征患者的正中神经微血管密度显着高于正常对照组[6],腕管近端正中神经内的血流明显并持续增加,直至术后至少3个月[7],提示受损神经内血流灌注情况可能影响预后的评估。然而,少有研究评估创伤性周围神经损伤在不同时期CEUS的变化。本研究评估了CEUS技术在创伤性周围神经损伤不同时期的应用价值。

　　材料和方法

　　实验动物及分组 4～6月龄雄性新西兰白兔30只,体质量2.5～3.0kg,由中国北京隆安实验动物养殖中心[许可证号:SCXK(Jing)2014- 0003]提供。采用随机数字表法将新西兰白兔随机分为5组(n=6):(1)正常对照组(CON组):仅暴露坐骨神经,未挤压损伤;(2)3-day 组:坐骨神经挤压伤后3d;(3)2-week组:坐骨神经挤压伤后2周;(4)4-week组:坐骨神经挤压伤后4周;(5)8-week 组:坐骨神经挤压伤后8周。本研究获中国人民解放军总医院伦理委员会批准(20130901- 001)。

　　动物模型建立 所有动物均于左侧大腿肌肉注射0.2 ml/kg陆眠宁(中国吉林长春兽医研究所)麻醉。将动物左侧卧位固定于手术台,右侧大腿备皮去毛,常规碘伏消毒、铺无菌洞巾后,沿大腿中部水平做纵向皮肤切口,钝性分离并暴露坐骨神经。在坐骨神经主干中部旁的肌肉组织处,固定细小无菌导管制作的光滑条形标记物,并用持针器钳夹此处的坐骨神经30 s,夹持程度为3扣,共造成1 cm的神经挤压伤。术后给予抗生素抗感染治疗5 d,青霉素80万U/d。

　　挤压伤神经常规超声及PDUS检测 采用迈瑞(Mindray,Resona 7)超声诊断设备,配备频率为4～15 MHZ的线阵探头(型号:L11- 3U)。动物置于左侧卧位,右下肢自然伸直。超声探头于神经横断面识别高回声导管标记物并确定神经挤压伤处,而后探头旋转90度,纵切面仔细扫查神经损伤区域,观察坐骨神经的连续性、内径、回声强度、内部及紧邻周围组织的细微血流及损伤神经与周围组织的关系。测量神经最厚处,取3次测量的平均值进行统计学分析,然后快速切换至PDUS模式,采集受损神经区血流灌注情况的相关静态图像进行分析。

　　挤压伤神经CEUS检测 采用迈瑞(Mindray,Resona 7)高分辨率超声造影成像系统,配备频率为4～15 MHZ的线阵探头(型号:L11- 3U)。将声诺维超声造影剂(SonoVue,Bracco Imaging,Milan,Italy)与5 ml 0.9%氯化钠水溶液混合均匀,经耳缘静脉团注(0.13 ml/kg),随后用2 ml盐水冲管。采用机器内置软件对动态储存60 s的CEUS视频进行定量分析。将感兴趣区域(region of interest,ROI)置于坐骨神经挤压伤部位,随后自动生成时间-强度曲线及组织内部血流灌注的相关参数。采用AUC反映组织内的相对血容量,达峰时间(time to peak,TTP)反映微泡达到最大强度的时间和峰值强度(peak intensity,PI)反映单次造影剂注射时的最大信号强度,以上3个参数综合评价神经组织的微血流灌注情况。每个视频定量分析3 次,取各参数3次测量的平均值进行统计分析。

　　组织学评估 CEUS评价完成后,过量麻药处死各组动物(n=4),获取损伤部位及其近端和远端的坐骨神经,剥离周围组织行NF200免疫荧光染色以观察轴突的再生情况。标本固定于4%多聚甲醛溶液,石蜡包埋,并切取4μm厚的纵向切片。用10%山羊血清室温封闭1 h后,滴加抗-NF200抗体(1∶200,N5389,Sigma)作为一抗,放于湿盒内4℃孵育过夜。次日,倒弃切片上剩余的液体,用PBS浸洗切片3次,每次5 min。然后避光滴加二抗IgG/Alexa 594(1∶200,ab150116,Abcam),室温避光孵育2 h。PBS浸洗3次后,用DAPI复染细胞核。每张切片选取5个随机视野,采用Image Pro 6.0 软件(Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)分析平均光密度值(optical density,OD)。

　　统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件,符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,组间均数比较采用t检验;非正态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示,组间比较采用非参数秩和检验;P<0.05为差异有统计学意义。

　　结 果

　　常规超声评价 CON组神经内径均匀,神经外膜光滑且连续性完整。挤压伤区域神经呈低回声,神经外膜的线性回声连续性差,与周围组织分界不清(图1)。CON组、3-day组、2-week组、4-week组和8-week组的神经内径分别为(0.92±0.11)、(1.37±0.23)、(1.71±0.21)、(1.43±0.19)和(1.14±0.15)mm,其中,3-day组(t=3.55,P<0.001)和2-week组(t=4.96,P<0.001)明显大于CON组,4-week组(t=6.09,P=0.66)和8-week组(t=4.89,P=0.34)与CON组差异无统计学意义。

　　PDUS评价 CON组坐骨神经内未见明显血流信号。3-day 组受损神经处可见点状血流信号且分布不对称,走形紊乱。2-week组神经周围可见极少细小点状血流信号。4-week组及8-week组受损神经处均未见血流信号。

　　CEUS评价 CON组中动脉早期可见造影剂在到达坐骨神经时显示1或多条供血动脉,几秒钟后毛细血管网充满微泡时坐骨神经均匀增强;3-day组动脉早期可见造影剂快速在神经挤压处显影,且增强强度显着高于CON组;2-week 组、4-week 组和8-week 组坐骨神经损伤处动脉早期可见造影剂的增强时间晚于周围组织,强度均低于CON组(图2)。

　　AUC:CON组、3-day组、2-week组、4-week组和8-week组分别为(1939.67±131.06)%、(2798.45±211.31)%、(1652.69±110.01)%、(1266.24±102.35)%和(907.82±88.17)%,其中,3-day组明显高于CON组(t=3.76,P<0.001),2-week组明显低于3-day组(t=5.12,P=0.007),8-week组明显低于4-week组(t=10.68,P=0.043)。

　　PI:CON组、3-day组、2-week组、4-week组和8-week组分别为(38.40±5.70)%、(45.33±5.27)%、(30.63±3.94)%、(27.05±2.78)%和(21.16±2.04)%,其中,3-day组明显高于CON组(t=5.21,P<0.001),2-week组明显低于3-day组(t=8.25,P<0.001),8-week组明显低于4-week组(t=7.52,P<0.001)。

　　图1 挤压伤坐骨神经常规超声纵切面图像(标记处为挤压伤后神经增粗部位)

　　Fig 1 Conventional ultrasound in longitudinal section image of sciatic nerve after crush injury(the mark is the part of nerve thickening after crush injury)

　　TTP:CON组、3-day组、2-week组、4-week组和8-week组分别为(7.49±1.07)、(5.03±0.89)、(10.18±1.92)、(13.77±2.03)和(15.89±2.41)s,其中,3-day组明显低于CON组(t=2.04,P<0.001),2-week组明显高于3-day组(t=7.03,P=0.009),4-week组明显高于2-week组(t=9.10,P<0.001),8-week组明显高于4-week组(t=3.77,P<0.001)。

　　组织学评价 CON组神经轴突粗细均匀,排列整齐、规则。神经挤压伤后轴突断裂,随时间变化逐渐出现再生,但轴突再生的速度缓慢。术后8周,轴突再生仍未能恢复至正常水平,表现为稀少、排列不均匀的再生轴突(图3)。CON组、3-day组、2-week组、4-week组和8-week组的中位累积OD值分别为18 784.8(15 904.5,21 103.5)、3876.5(3137.1,4683.0)、7051.6(5941.4,7922.6)、10 150.1(7477.4,11 839.9)和12 035.6(10 566.3,14 805.8),其中,2-week组与3-day组差异无统计学意义(H=13.52,P=0.2110);4-week组明显高于2-week组(H=9.16,P=0.0100);8-week组明显高于4-week组(H=7.11,P=0.0090)但明显低于CON组(H=7.28,P=0.0003)。

　　图2 坐骨神经挤压伤后不同时期超声造影与灰阶对比图

　　Fig 2 Images of contrast-enhanced ultrasonography and gray scale in different periods after crush injury of sciatic nerve

　　A.CON组;B.3-day组;C.2-week组;D.4-week组;E.8-week组

　　A.CON group;B.3-day group;C.2-week group;D.4-week group;E.8-week group

　　图3 挤压伤处各组坐骨神经组织行NF200免疫荧光染色

　　Fig 3 Histological evaluation of sciatic nerve at crush injury site(NF200 immunofluorescence staining)

　　红色:轴突;蓝色:细胞核A.CON组;B.3-day组;C.2-week组;D.4-week组;E.8-week组

　　Red:axon;blue:nucleusA.CON group;B.3-day group;C.2-week group;D.4-week group;E.8-week group

　　讨 论

　　本研究发现,坐骨神经挤压伤后常规高频超声显示损伤神经早期水肿增厚,随时间进展,损伤神经的内径及内部回声可逐渐恢复并接近正常对照组,损伤神经是神经纤维变性、坏死及再生的动态变化过程,对其无法准确显示神经纤维再生情况,进而难以评估神经损伤后的预后程度。PDUS结果显示,尽管其在损伤急性期时敏感度较高,可显示损伤神经内部的细微血流信号,但在慢性期及修复期时则无法清晰显示。此时,CEUS则突显其优势,因其无辐射及无肾毒性,且是纯血池显像,故可在神经损伤后的任意时期安全、有效、可重复地评价神经内部的微循环,并与组织病理学对比分析,对神经再生程度的预判起重要作用。因此,常规超声及PDUS不足以充分评估神经再生,限制了对损伤神经内微循环的探索,而CEUS的检测必不可少。

　　本研究结果显示,CEUS可为周围神经损伤提供有价值的信息。以往有研究应用CEUS检测腕管综合征患者正中神经的微血流灌注变化,结果显示,腕管综合征患者的平均AUC测量值明显大于对照组,与本研究中受损神经处AUC研究结果表现出相同趋势。然而,该研究未发现AUC与电诊断检测结果之间有明显的相关性[6]。Evans等[8]将临床前动物研究的超声造影方案成功应用于灵长类动物模型,检测了正中神经内的微血流,结果表明动物肢体在工作阶段,正中神经微血流灌注增加。然而,少有研究使用CEUS来评估周围神经损伤后微血流灌注的变化。本研究发现,坐骨神经挤压损伤后3d时血流灌注增加,文献表明这是早期反应性充血以使神经免受缺血损伤,并被认为与降钙素基因相关肽的局部表达相关[9,10]。随着时间推移,神经内血流灌注逐渐减少,推测可能与再生微血管数量减少有关。微血管再生数量减少可能又与神经的急性压迫造成血管机械性损伤,引起持续的神经内部微循环障碍有关[11,12]。因此,神经压迫解除后出现高灌注或低灌注可能取决于压迫的严重程度和持续时间。本研究中,钳夹程度为3扣,可能由于压迫程度较重导致神经内部结构及微环境严重受损,支持轴突再生的微血管再生受到抑制。

　　此外本研究还发现,术后8周时轴突再生仍未能恢复至正常水平,与正常对照组差异显着,提示轴突再生缓慢。分析轴突再生缓慢可能与局部的微血流灌注减少有关[13]。既往研究显示,微血管为轴突的再生提供营养物质并引导轴突的生长方向,当微血管受损且新生过程受到抑制时,再生轴突明显减少[14,15,16],影响神经的再生修复。故损伤神经的微血流灌注情况对神经后期的修复起着重要作用[17,18]。因此,CEUS可弥补常规超声及PDUS技术的不足,进一步对神经内微血流灌注情况进行监测,有助于更为全面评价神经修复再生及指导后期治疗。

　　在临床中,CEUS对损伤神经的微血流灌注情况的评估并不适用于所有人群,例如对于微循环障碍或糖尿病周围神经病变者,其神经周围的血流会比正常人少;而对于炎症性病变,如肌炎等,由于肌肉充血其神经周围血流会比正常人丰富[19]。但也有相关研究显示,CEUS在兔的糖尿病周围神经病变中可对其坐骨神经的微血管病变进行评估。故CEUS对各类疾病的神经内微血流灌注情况有待进一步研究。

　　本研究存在以下局限性:(1)未将CEUS参数结果与病理的微循环密度等参数进行对比研究。(2)研究中样本量较少,在评估损伤神经的微循环灌注上有待于大样本的深入研究。

　　综上,本研究结果发现,CEUS技术可在神经损伤的任何时期进行微血流灌注的定量评价,从而在神经损伤的早期就可发现并选择最适合的治疗方案,及时有效地改善神经内微循环情况,以促使神经再生,最大限度恢复神经的功能,为神经再生及后期修复治疗的评估提供有价值的信息。