CRISPR/Cas作用机制及最新研究成果-985毕业论文网

基因组编辑是指定点改造基因组，得到预期的生物体基因组序列从而发生遗传改变的技术，主要是进行 DNA 序列的敲除、插入、定点突变和组合编辑等，从而实现基因功能与调控元件的系统研究[1].基因组编辑技术日益成为生物学研究的热点，目前基因组编辑技术主要包括巨核酶技术、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应因子核酸酶技术及CRISPR 相关核酸酶技术[2].它们在基因工程中已经得到了诸多成功的应用，然而上述传统的基因组编辑技术存在明显的不足。例如，锌指核酸梅（zinc-fingernucleases,ZFN）和转录激活因子样效应因子核酸梅（transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN）核酸酶技术原理几乎是一样的，而一个新的 ZFN 和 TALEN 嵌合蛋白均需改造才能识别靶序列，这就使得两种基因组编辑技术的广泛推广应用受阻，但 CRISPR 相关核酸酶技术只需要一小段引 导 RNA（guideRNA、g RNA） 就 能 识 别 特 定 的DNA[2],且一个新的位点只需要一个新的 g RNA,极大的简化了基因组编辑的过程，扩大靶位点的选择，具有更大的潜力。CRISPR 系统也可以应用于靶向基因突变和基因修正，可以实现大片段 DNA 的缺失以及复合基因编辑。
　　
　　本文将针对 CRISPR/Cas 系统的结构、分类、原理以及目前具有突破性研究并迅速发展的 Type ⅡCRISPR/Cas 系统和 Type ⅢCRISPR/Cas 系统的突破性研究做较为详尽的综述。
　　
　　1  CRISPR/Cas的基因座结构
　　
　　CRISPR/Cas 的基因座结构相对简单（图 1），对于一个有效的 CRISPR/Cas 系统而言，通常包含两个部分 :第一部分是位于基因组中正向重复序列和来源于外源 DNA 的间隔序列组成 3‘端 CRISPR 基因座，对于重复序列而言在长度和序列上几乎一致，在不同的物种之间长度范围在 21-47bp,平均在32bp[3,4];间隔序列在长度上是一致的，长度范围在 20-72bp,但在序列上表现出多样性[4,5].亲缘关系相近的物种具有相似的重复序列，但是在全部的细菌和古细菌序列中间隔序列和重复序列都表现出极大的差异[6].第二部分是位于 CRISPR 基因座 5’端成簇的 Cas 基因，主要包括一些核酸酶、解旋酶、聚合酶和 RNA 结合蛋白等，主要参与 CRISPR/Cas系统介导的免疫过程[7].
　　
　　2  CRISPR的分布与分类
　　
　　目前对于 CRISPR/Cas 系统而言主要分为 3 种类型 :Type Ⅰ、Type Ⅱ、Type Ⅲ三种不同类型[8],从另一方面也反映出在自然界中 CRISPR/Cas 系统具有多态性。
　　
　　Type Ⅰ CRISPR/Cas 系统在细菌和古细菌中被发现，包含 6 种不同的 Cas 蛋白，其中在干涉反应中最重要和最显着的是 Cas3 蛋白，它包含一个 HD磷酸化水解酶结构域和一个类 DEx H 解旋酶结构域，这两个结构域在 ATP 和Mg2+存在的情况下能够解开ds DNA（解旋酶结构域）和切割 ss DNA（HD 核酸结构域）[9].
　　
　　Type ⅡCRISPR/Cas 系 统 仅 仅 在 细 菌 的 基 因组中发现[9],其中 Cas9 是分子量很大的多功能蛋白， 参 与 cr RNAs 的 成 熟 和 随 后 的 干 涉 反 应[10].Cas9 蛋白包含有两个亚基，在 Mg2+存在条件下，其中 Mcr A/HNH 切割与 cr RNA 互补的 DNA 链，而类Ruv C 切割非互补链[9].
　　
　　Type ⅢCRISPR/Cas 系统主要在古细菌中发现，包括 typeIII-A 和 typeIII-B 两种类型，两者的差别主要是A型干扰的靶标是 m RNA,B 型干扰的靶标是 DNA[11], 其 中 typeIII-B 系 统 与 其 他 1 或 2 种CRISPR 亚单位相结合[9].
　　
　　typeIII-B 系统特征性蛋白是 Cas10 蛋白，而Cas10 蛋白具有 RNA 活性参与 cr RNA 的成熟和剪切入侵外源 DNA[9,10].
　　
　　最近几年，CRISPR/Cas 技术因其相对较为简单，而得到较为迅速的发展，如在作物育种、基因治疗以及动物建模等领域都已得到广泛的应用[12].随着测序技术的不断发展，越来越多的细菌和古细菌的基因组信息被解密，为后续 CRISPR/Cas 系统的改造和应用提供更加有力的指导。
　　
　　3  CRISPR/Cas作用机制
　　
　　3.1  TypeⅡ CRISPR/Cas系统基本原理
　　
　　一个简易的 Type ⅡCRISPR/Cas 系统必定要含有 Cas9 和 g RNA,Cas9 核酸酶具有改造 cr RNA 和破坏双链 DNA 的双重功能[13],位于 g RNA5‘端的 20个左右的碱基决定 CRISPR/Cas9 系统在应用时 Cas9核酸酶特异性切割的部位，主要负责决定 CRISPR/Cas9 系统的特异性。
　　
　　基 本 原 理（ 图 2）：首 先，Cas9 蛋 白 与 g RNA形成复合体 ;其次，上述复合体切割与 g RNA 的spacer 互补的基因组 DNA 序列 ;随后造成双链 DNA的损伤 ;最后通过体内的 NHEJ 或 HR 修复机制将引入基因突变[14].
　　
　　3.2  TypeⅢCRISPR/Cas系统基本原理
　　
　　Type ⅢCRISPR/Cas 系统包含的两种类型中以A 型研究较为突出，这里以 typeIII-A为例。A型干扰的 m RNA 首先转录形成 DNA,Cas10-Csm 核糖核蛋白体，在 cr RNA 的引导下对与 cr RNA 互补的DNA 双链或单链进行切割[16],从而造成 DNA 的损伤（图 3）。
　　
　　4  CRISPR/Cas系统之间的比较
　　
　　Type ⅡCRISPR/Cas 系统在最近几年研究火热，其突出的优点在于结构简单，系统容易设计，仅需要较短的 g RNA 和 Cas9 核酸酶就可以完成对特定靶基因的人工编辑，但是该系统存在较严重的脱靶把效应，使其广泛应用受到限制。
　　
　　Type ⅢCRISPR/Cas 系统与其他两种类型相比存在自己独有的亮点 :（1）Type ⅢCRISPR/Cas 系统只有在靶 DNA 转录的情况下才发挥功能。（2）Cas10-Csm 复合物不仅具有执行引导 RNA 切割 DNA的能力，也具有切割 RNA 的能力。这些突出的优点揭示了一种全能型的 CRISPR 免疫系统[16].
　　

5  CRISPR/Cas系统最新突破性研究
　　
　　随着生物学研究的迅猛发展，CRISPR/Cas 系统也出现令人难以置信的新突破，为基因组编辑技术的广泛应用开辟了更为广阔的道路。
　　
　　5.1技术创新
　　
　　真核细胞具有较为复杂的转录调控系统，基因组中不同的位点采用不同的调控方式，利用这一原则，通过延长引导 RNA 使其包含效应蛋白的结合位点，从而开发了一种 CRISPR 支架 RNA（sc RNA），利用 sc RNA 能够开发多基因转录程序，在控制一部分基因激活的同时又抑制了另一部分基因[17].这一突破为基因表达程序的构建提供了强有力的技术支撑，也为细胞重组和研究代谢途径等开辟新的道路。
　　
　　在 Type ⅡCRISPR/Cas 系 统 中 Cas9 具 有 重 要的作用，初始的 Cas9 大多都是来源于酿脓链球菌即Sp Cas9,但是在金黄色酿脓葡萄球菌中发现了一种新的 Cas9 即 Sa Cas9,在相关实验发现体内调节基因组编辑效率方面 Sa Cas9 要比 Sp Cas9 高出很多[18].一种高效的 Cas9 核酸酶的发现攻克了基因组编辑面临的一大挑战，在东京大学相关研究设计了一种光激活的 Cas9,能够光控 CRISPR/Cas9 基因组编辑，在空间和时间上更好地控制 RNA 引导的核酸酶的活性[19];Sato 实验室也相继推出了光活化系统来切割目标 DNA 序列，进行光活化的基因组修饰，他们采用每个 Cas9 片段与一个二聚化的结构域相融合，创建了光活化的 Cas9 工具 ;AlexanderDeiters 的实验室利用遗传编码的光照技术，在 Cas9 蛋白中插入硝图2  Cas9介导的基因组编辑原理[15]图基苯笼罩的赖氨酸，最终发现这种新型的 Cas9 系统能够让内源的基因表达沉默。这些技术的革新使人们能够更好的了解复杂的基因网络，也能很好的应用于医学方面。
　　
　　5.2  疾病研究
　　
　　基因组编辑技术在医学方面的应用也越来越多，如进行基因治疗和构建疾病模型等。
　　
　　5.2.1构建疾病模型骨髓瘤是一种进行性肿瘤性疾病，目前对它的致病机理还不是很清楚，因此构建该疾病的模型，对于研究其致病机理和药物筛选有重要的作用。
　　
　　小鼠的骨髓瘤疾病模型已被构建，研究小组将g RNA 和表达 Cas9 蛋白的慢病毒表达载体构建出简易的 Type ⅡCRISPR/Cas 系统，然后将表达 5 种微小 g RNA 慢性病毒载体组合在一起，导入小鼠的造血干细胞中，从而形成恶性肿瘤的单克隆 ;最后，将细胞注射到小鼠体内，结果表明 CRISPR/Cas 系统在多基因作用的模型建立上是有效的，能够较好的反应人类的疾病[20].
　　
　　最 近，Broad 研 究 所 和 麻 省 理 工 学 院 DavidH.Koch 综合癌症研究所的诸多科学家们利用 Cas9核酸酶技术在构建的癌症动物模型中系统地“敲除”（关闭）了整个基因组的所有基因，从而揭示出与肿瘤进化和转移紧密相关的部分基因，同时也表明Cas9 核酸酶筛选技术也成为在体内系统分析肿瘤进化过程中基因表型的可靠技术[21].为医学研究和临床治疗肿瘤，提供了新的思路和技术。
　　
　　5.2.2基因治疗目前对于 HIV-1 型艾滋病的治疗尚不存在显着的治疗手段。Ebina 等[22]尝试利用CRISPR/Cas9 技术对 HIV-1 感染的 T 细胞的 LTR 区进行打靶，结果显示它能有效降低细胞内前病毒的水平 ;韩英伦等[23]利用 CRISPR/Cas9 技术对哺乳动物的造血干细胞进行改造，成功遏制了 HIV-1 病毒的感染作用，与此同时发现，它还能作用 HIV-1原病毒的 LTR 区彻底清除原病毒，对 CRISPR/Cas9技术进行改造实验发现它可以识别并激活 HIV-1 原病毒，如果结合 HAART 药物，结果能够彻底清除体内的 HIV-1 原病毒。
　　
　　EB 病毒感染能够引起肿瘤和非肿瘤性疾病，严重危害人类健康，Wang 等[24]利用 CRISPR/Cas9 技术体处理 EB 病毒潜伏感染的人类淋巴瘤细胞，结果发现有 25% 感染的细胞被清除，50% 的细胞中，EB 病毒负荷明显减少。由此可以预测，从人类感染的细胞中完全除去 EB 病毒，用于治疗相关疾病指日可待。
　　
　　CRISPR/Cas9 技术除了上述在病毒感染疾病基因治疗中取得显着成效以外，对一些遗传性疾病，例如 :白内障、地中海贫血、囊性纤维病等基因突变引起的相关疾病研究中也已取得显着成果。
　　
　　5.3  植物学研究
　　
　　从基因组的角度出发对植物基因进行人工改造从而培育优良品种具有非常重要的意义，由于外源DNA 与基因组靶基因发生同源重组效率很低，因此对植物基因组进行人工改造就显得异常困难。受序列的限制以往的 CRISPR 载体往往是两个载体，也即表达 g RNA 和 Cas9 元件位于不同的载体，共转化效率较低，为了克服这一困难，我们可以试想利用同源重组技术和改进后的定点突变技术将基因特异的靶序列构建到通用载体中得到表达特异基因 g RNA的入门载体，将其与目标载体同源重组从而构造特异的基因表达载体。
　　
　　CRISPR/Cas 系统在植物学方向的研究很多，但大多局限于研究去修饰和改造一个或多个靶位点。最近，华南农业大学研究人员利用 PCR 技术扩增形成多重 g RNA 表达带，再将其组装到 CRISPR/Cas9表达载体上，从而发现一种适合于单子叶和双子叶植物，高效且方便的多重基因组编辑的强大的CRISPR/Cas9 系统[25],为后续进行植物基因组改造、整合和培育新的品种提供技术支撑。
　　
　　5.4  昆虫学研究
　　
　　在昆虫方向的研究大多局限于采用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，目前已经在果蝇、家蚕、埃及伊蚊体内利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术进行基因敲除和插入研究，为进一步研究基因功能提供新的思路和技术手段。
　　
　　2014 年，Liu 等[26]在家蚕细胞中利用 CRISPR/Cas9 系统进行 6 个基因的敲除，在敲除 Bm702 基因的同时实现外源基因在该位点的成功插入 ;2015年，辛虎虎[27]在家蚕丝腺相关基因 Bmsage 的研究中采用 CRISPR/Cas9 系统进行基因的敲除和功能分析取得良好效果 ;2015 年，Kistler 等[28]在埃及伊蚊产卵后的 3h 内注射 g RNA 与 Cas9,敲除 Wtrw 基因并插入包含 stop 位点的 ss ODN 供体片段，采用Cas9 核酸酶系统对目的 DNA 进行切割和 HR 修复，在埃及伊蚊内插入 ECFP 阅读框，子代可在荧光显微镜下显示特殊的蓝色，便于形态学观察。利用CRISPR/Cas系统对昆虫基因功能的研究和注释，为人类了解和探究大自然产生深远的影响。
　　
　　6结语
　　
　　目前，CRISPR/Cas 系统相关的基因组编辑技术已在多个研究领域广泛应用，尽管其中潜在着许多待解决的问题，如 Type ⅡCRISPR/Cas 系统中 DNA解旋是本身具有解旋能力还是由于 DNA 复制或转录的过程引发 DNA 解旋[11],如何确保临床应用中的安全性和有效性等 ;作为 RNA 编辑的 Type ⅢCRISPR/Cas 系统目前仍有分子机制尚不明确。但作为第三代基因组编辑技术工具无论是从方法上还是实验成本上都是传统基因修饰和第二代基因组编辑技术无法取代的。
　　
　　基因组编辑技术普遍存在细胞毒性和脱靶效应两大问题，由于 CRISPR/Cas9 系统自身存在脱靶效应，也使其在推广研究应用中受到或多或少的限制，对于降低 Type ⅡCRISPR/Cas 系统的脱靶效应，可以考虑以下几个方面 :（1）适当减少 Cas9 蛋白和g RNA 的递送量。（2）对打靶位点进行严谨的筛选和过滤。（3）Cas9n 和 g RNA 配对使用，形成 5’端突出的末端。（4）精确设计和控制 g RNA 的长度以此降低 g RNA 和非目标序列的结合率。
　　
　　CRISPR/Cas 系 统 目 前 多 数 还 处 于 基 础 研究，有些深层次的技术还有待于开发和应用，例如 Type Ⅰ CRISPR/Cas 系 统 还 未 见 报 道，2015 年Type ⅢCRISPR/Cas 系统在 Cell 上发布有突破性进展，但随着基础学科的不断深入，CRISPR/Cas 系统也会得到更为广阔的发展和应用前景。CRISPR/Cas系统的不断优化和提升，对未来医学领域 :医学研究与医学临床治疗、药物开发、耐受药物细胞模型的建立与筛选、人源化器官的克隆移植 ;分子标记领域 :药物靶向追踪、活细胞中特定结构基因构象分析 ;基因组学领域 :功能基因研究、高通量功能基因鉴定与筛选、基因组改造与整合，CRISPR/Cas系统都已表现出巨大的应用潜力和研究开发价值。