鱼精蛋白的获取与应用领域分析-985毕业论文网

摘    要：　综述了强酸提取鱼精蛋白的机理和应用的领域, 重点介绍了鱼精蛋白在体外循环手术的应用与发展、抗菌机理及在防腐方面的优势, 并阐明市场原料供应不足的现象, 以期为鱼精蛋白的应用提供参考。

　　关键词：　鱼精蛋白; 抗菌; 防腐; 应用;

　　Abstract：　The mechanism and application area of protamine by strong acid extraction were summarized.The application and development of protamine in extracorporeal circulation surgery, antibacterial mechanism and antiseptic application were highlighted.This article also explained the shortage of raw materials supply in the market, in order to provide references for the application of protamine.

　　Keyword：　protamine; antibacterial; antiseptic; application;

　　鱼精蛋白是一种蛋白质, 其主要组成为多聚阳离子肽, 存在于各类雄性动物的成熟精巢组织之中, 一般与核酸紧密结合, 以核精蛋白的形式存在。鱼精蛋白的分子量比较小, 通常情况下仅由30个左右的氨基酸缩合而成, 以精氨酸为主。

　　1 抗菌机理

　　食品防腐剂常用对羟基苯甲酸醋类、苯甲酸、山梨酸及其盐类等药品, 它们主要通过化学手段合成。随着经济的不断发展和人民生活水平及文化水平的逐步提高, 人们对食品添加剂安全提出的要求也不断提升, 这说明人们对食品安全问题越来越重视。鱼精蛋白所具有的广谱抗菌作用可经过鱼类精巢特有的物质分离纯化后获得, 可以作为天然防腐剂使用, 它的这一特性也越来越受广大学者的关注与青睐。

　　近年来, 国内外报道很多, 鱼精蛋白作为一种易获得的天然提取物, 不仅在安全性上有保障, 而且还具有很强的抗菌活性, 同时具备在广泛pH值范围内的适用性、热稳定性等优点。它以含量丰富的精氨酸为主, 是具有很高的营养价值和功能性的蛋白类物质。与目前广泛存在的化学防腐剂相比, 鱼精蛋白具有抗菌谱较窄和抗菌效果差的劣势。目前, 人们试图提高抗菌性能的主要方式是通过分子层面进行修饰。例如昆虫抗菌构效关系的试验研究结果表明, 抗菌肽的活性与分子层面上的螺旋度有着密切的相关性, 一旦两性分子螺旋度发生改变, 相应的抗菌肽活性也会受到一定的影响。在氨基酸残基中, 一旦用高倾向螺旋度的残基代替低倾向度螺旋的残基, 可以明显提高抗菌肽的活性。因此, 目前获得新抗菌肽药物的途径主要是从分子层面改造抗菌肽类残基。增强天然肽类防腐剂抗菌效果的方式多为与其他添加剂配合使用, 例如螯合剂EDTA可以将革兰阴性菌中含脂多糖的外层膜部分除去, 从而达到提高抗菌效果的目的。

　　杜荣茂[1]针对影响鱼精蛋白抗菌活性的因子进行了试验, 主要针对的理化因子是鱼精蛋白的毒性因子, 试验结果表明, 金属离子与鱼精蛋白抗菌活性之间成负相关性, 且影响力随着金属离子的浓度增大而增大。由此得出, 细菌细胞膜表面存在的阴离子与鱼精蛋白表面的阴离子都可与金属离子结合, 二者存在竞争效应, 当金属离子过量时, 正电荷增多, 鱼精蛋白被置换出来, 导致抗菌作用变差。王灵桥等[2]针对鱼精蛋白主要作用位点是细胞壁进行试验, 发现鱼精蛋白在抗菌过程中既可以作用于细胞壁上的肽聚糖, 也可以通过细胞质膜上的负电荷进行定位, 影响膜分子动力和阻碍细胞膜蛋白质的合成, 最终鱼精蛋白通过对二者的协同起到抗菌作用。王南舟等[3]从鲑鱼中提取鱼精蛋白, 对食品中常见污染菌的抗菌能力和范围进行分析, 通过探讨温度、无机盐成分等参数对鱼精蛋白抗菌效果的影响得出最终结论, 鱼精蛋白作为富含精氨酸的抗菌剂, 在具有高安全性的同时还具有广谱高效的抗菌活性, 营养丰富, 热稳定性良好, 在碱性条件下更有助于食品防腐, 受二价金属盐离子的影响较大。

　　2 获取方式

　　鱼精蛋白的主要获取方式为提取和纯化。提取即以强酸 (多为硫酸或盐酸) 作为提取剂溶剂, 加入纯化剂 (常用柠檬酸盐和有机溶剂) 来提取。近些年来, 随着提取工艺的发展, 鱼精蛋白的提取方式也呈现多样化, 例如先制备鱼精蛋白盐类, 经过稀酸处理后, 抽取目标蛋白, 针对抽取液加入醇类, 分离干燥后溶解、离心获得目标蛋白。同时, 也有人用无机盐类物质将目标蛋白沉淀, 通过复分解反应得到鱼精蛋白。

　　赵利等[4]将目标蛋白加入到氯化钠 (NaCl) 溶液中, 离心、分离、沉淀后收集沉淀, 再加入稀释过的盐酸 (HCl) 溶液将沉淀捣碎后静置并离心, 取离心管内上清液, 滴加有机试剂, 至沉淀完全后收集产物, 最终溶于丙酮, 并调至酸性 (pH值1.8) 。在溶液中加入体积比为1∶1冷丙酮, 通过离心、真空干燥, 最终得到的产物就是目标蛋白盐。刚提纯后得到的鱼精蛋白纯度并不高, 内部含有大量的核酸蛋白、细胞膜及杂蛋白等杂质, 需要进一步进行纯化。在电聚焦过程中 (如聚丙烯酰胺等) , 鱼精蛋白由于是一种碱性蛋白质, 其表面具有大量正电荷, 在碱性端正电荷发生聚集, 而蛋白质条带中处于中性和酸性区域的均是杂蛋白。在完成电聚焦后聚丙烯酰胺等物质可去掉碱性端, 经过扩散洗脱处理后透析, 凝胶过滤层析后获得产品。当鱼精蛋白粗提物在通过凝胶过滤柱时, 溶液中的不同物质可以因为扩散系数不同而分离, 鱼精蛋白分子可以进入到凝胶孔内, 而其他蛋白不能进入, 经过洗脱即可获得鱼精蛋白分子[5]。另一种方法就是采用葡聚糖凝胶柱层析法纯化。在纯化过程中, 利用葡聚糖中呈酸性的基团———羧基与呈碱性的鱼精蛋白发生吸附作用, 从而达到洗脱效果, 试验中常常通过添加盐来减弱此种吸附作用, 分离方法与上述一致。在纯化过程的最后, 使用质谱对其等电点和分子质量进行最终确定[6]。

　　3 原料来源及回收利用

　　由于鱼精蛋白只能从鱼的精子中获得, 不能进行工业化制造, 从而限制了其产量。硫酸鱼精蛋白成分比较复杂, 又因鱼种不同, 其结构也不尽相同。针对目前国内市场流通的鱼精蛋白来源, 刘倩等[7]通过HPLC方法鉴别硫酸鱼精蛋白的含量, 为完善相关质量标准提供了数据支撑, 且通过上述检测方法对我国目前上市的硫酸鱼精蛋白原料鱼种来源进行鉴别, 以氨基酸为目标组分进行考察, 重金属含量采用的是电感耦合等离子质谱法进行检测, 并且考察了不同鱼种来源的硫酸鱼精蛋白原料对肝素的中和能力。结果表明, 目前我国市场上的硫酸鱼精蛋白主要原料鱼种为鲑鱼和鲱鱼。

　　刘琳等[8]采用2种阴离子型表面活性剂对鱼精蛋白进行回收, 表面活性剂为十二烷基硫酸钠和2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠。试验方法是沉淀鱼精蛋白, 并用极性有机溶剂对沉淀中的鱼精蛋白残留进行二次溶解回收。结果表明, 鱼精蛋白可以在十二烷基硫酸钠中完全沉淀分离, 但是表面活性剂2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠能沉淀出的鱼精蛋白最多只有75.02%;试验过程中还发现极性有机溶剂种类的选择使用、添加无机盐离子的量等因素, 对鱼精蛋白二次回收均有较大的影响。

　　4 在医药领域的应用

　　自20世纪80年代开始, 鱼精蛋白作为一种天然、可食用的防腐剂, 广泛替代了化学防腐剂。与常规化学方式合成的防腐剂不同, 鱼精蛋白除了安全之外还兼有很多优点, 如具有宽适用范围的pH值跨度、防腐性能好、受热能力高、热稳定性好等。鱼精蛋白作为含量丰富的由精氨酸缩合而成的蛋白质, 除了具有很高的营养价值外, 还具有抑制血液凝固、降血压、抑制肿瘤、强化肝功能、抗血栓等多种功效。如今, 鱼精蛋白的使用不仅仅体现在食品行业中, 在医学领域也得到越来越广泛的应用。

　　鱼精蛋白作为蛋白酶抑制剂可以减少消化酶对药物的破坏, 其所含的酪氨酸和精氨酸可以作为胰蛋白酶的特异性作用底物。口服时, 酶蛋白分子中的酶切位点增多, 竞争性增强, 降低酶活, 对蛋白质类药物胰岛素起到保护作用。祁荣等[9]在SNAC、鱼精蛋白和酪蛋白的共同作用下, 通过试验证实INS肠溶微球溶液具有更有效的降血糖作用。由此可以得出, 抑制酶对INS的降解原理是酪蛋白 (高浓度) 和鱼精蛋白的协同作用。鱼精蛋白的协同作用, 可以增加口服降血糖药剂的作用强度和时间, 这一特点在蛋白质类药物制剂中尤为突出, 且在体内药效学中得到证明。因此, 将鱼精蛋白加入药物制剂中, 以期提高INS的口服生物利用度。

　　鱼精蛋白还应用在体外循环治疗过程中, 但会出现过敏反应等不良症状。方万香等[10]总结心脏直视手术过程中的619例病例资料发现, 使用鱼精蛋白后发生过敏反应的有36例, 发生率为5.8%。其中, 有33例发生于常规术后反应中和肝素, 3例发生于备体外循环移植术中中和肝素后。结果表明, 36例过敏患者中31例反应较轻, 经过减缓或停止鱼精蛋白用药后, 结合相应的对症处理, 症状可很快得以缓解;重度过敏反应案例出现5例, 经抗过敏药物等处理效果不佳, 再次肝素化体外循环转流后转危为安, 未出现生命危险。

　　鱼精蛋白是目前市场上中和肝素的常规药物, 多用于体外循环手术中。体外循环中使用鱼精蛋白可造成的不良反应有3种类型:快速给药型、过敏反应型、严重肺血管收缩型。王福昌等[11]总结了5个主要预防措施:一是时刻做好预防及抗过敏的准备, 保证对可疑的鱼精蛋白过敏者实时监控;二是经左心缓慢给药;三是在使用鱼精蛋白过程中可同时配合使用钙剂或H受体阻滞剂;四是在使用过程中, 应使用小剂量的鱼精蛋白, 以避免发生使用过量造成病人伤亡;五是在体外循环手术中更多地使用鱼精蛋白替代物及肝素清除装置等。

　　李龙江等[12]研究鱼精蛋白对肿瘤生长是否有抑制作用, 试验后得出结论, 通过服用鱼精蛋白可抑制肿瘤血管的生成, 同时在一定程度上可限制肿瘤细胞增殖, 并且通过与其他药物配合后可诱导其凋亡。因此, 可以利用血管生成、限制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡的共同作用来抑制肿瘤生长, 从而达到治疗肿瘤的目的。

　　5 在其他领域的应用

　　鱼精蛋白可以辅助治疗男性不育, 目前, 国内外取得的研究成果表明, 鱼精蛋白与改善成人生育能力方面有着密切的联系。鱼精核蛋白中的DNA具有促进活化细胞物质、增强机体抵抗力、增强机体生殖功能的作用;精氨酸可强化肝功能, 也能够解除机体疲劳、刺激垂体释放更多性腺激素;此外, 鱼精蛋白内部还含有许多的微量元素锌, 锌元素形成盐类后可使血浆酮含量成倍增加, 提高精子成活率。造成男性不育的原因可能与男性精液生殖细胞中鱼精蛋白的缺失或量的减少有关, 鱼精蛋白含量多少也可能影响人类生育能力。许多抗生育药的机理是干扰HPRR的合成, 其药理作用是它们的存在可抑制鱼精蛋白的生物合成, 使精子核蛋白在DNA转录生产过程中受阻。鱼精蛋白含量下降会导致精子核蛋白组发生异变, 进一步会使精子染色体发生变异, 导致分裂不完全。鱼精蛋白在辅助治疗男性不育方面作用显着, 可以治疗因精子质量不高引起的男性不育症。给雄性大白鼠口服鱼精核蛋白5个月后发现, 试验组与对照组相比肌肉中ATP、糖源含量增加, 精巢中DNA含量 (即精子数量) 增加, 生殖能力增强。由此表明, 鱼精核蛋白可为男性不育症新药的开发提供新的指导方向, 也可以成为辅助治疗的天然原料[13]。

　　同时, 鱼精蛋白作为一种天然食品防腐剂, 制备原料安全卫生, 除了有抑菌范围广的特点外, 还具有一定的保健, 可应用于很多领域[14]。一是在酸性食品的保存领域, 常通过与酸性防腐剂复配进行增效;二是可在碱性食品的防腐保存功能领域上应用;三是与加热等物理消毒方法合并使用, 在热敏性食品的防腐与加工上使用;四是研制功能性食品添加剂, 可改善生育情况, 消除身体疲劳, 对体质弱的群体效果尤为突出。

　　鱼类精巢原料量有限, 限制了鱼精蛋白防腐剂的广泛应用。目前人们正在尝试通过基因工程在微生物中以融合蛋白质的形式表达抗菌肽基因, 但仍存在表达产物少的问题。因此, 提高防腐抗菌肽类的产量、降低成本, 是目前必须解决的问题之一[15,16,17]。

　　参考文献：

　　[1]杜荣茂.鱼精蛋白抗菌特性及毒性[J].食品工业, 2003 (3) :11-13.
　　[2] 王灵桥, 杜荣茂, 付红霞, 等.鱼精蛋白杭菌机制的研究[J].微生物学杂, 2013 (23) :48-52.
　　[3]王南舟, 钟立人.鱼精蛋白抗菌特性的研究[J].食品科学, 2000 (21) :43-46.
　　[4] 赵利, 谢俊杰, 黄美芳, 等.鱼精蛋白的提取及抑菌作用初探[J].江西农业大学学报.2003, 25 (5) :543-545.
　　[5]上官新晨, 蒋艳, 沈勇根, 等.鱼精的研究与开发[J].江西农业大学学报, 2003, 25 (5) :742-746.
　　[6]傅红霞, 杜荣茂, 应铁进, 等.鱼精蛋白的研究现状及其发展前景[J].食品科技, 2003 (4) :25-27.
　　[7]刘倩, 李震, 张媛.不同来源硫酸鱼精蛋白原料药的质量研究[J].中国药学杂志, 2017 (52) :1451-1456.
　　[8]刘琳, 付朝霞.表面活性剂沉淀鱼精蛋白及复溶回收过程研究[J].食品科学, 2010 (31) :56-59.
　　[9]祁荣, 平其能, 徐瑞阳, 等.酪蛋白和鱼精蛋白对胰岛素酶降解和口服降血糖作用的影响[J].药学学报, 2004 (10) :17.
　　[10]方万香, 何庚戌, 陈连武.心脏手术鱼精蛋白过敏反应的治疗经验[J].中国体外循环杂志, 2010 (8) :39-40
　　[11]王福昌, 韩忠.体外循环中应用鱼精蛋白的不良反应及其预防[J].铁道医学, 2001 (29) :278-279
　　[12]李龙江, 温玉明.肿瘤血管生成的实验研究方法[J].国外医学, 1993 (3) :25-27.
　　[13]蒙学莲, 郑亚东, 才学鹏.鱼精蛋白的研究现状及应用[J].科技教育, 2007 (5) :26-27.
　　[14]穆云龙, 余旭亚, 孟庆雄, 等.鱼精蛋白的研究与开发[J].食品与药品, 2006 (8) :11-13.
　　[15]周玲, 汪学荣, 彭顺清, 等.鱼精蛋白的抑菌作用及其应用[J].肉类工业, 2004 (1) :37-39.
　　[16]廖云姝.体外循环中鱼精蛋白不良反应分析及护理对策[J].实用临床护理学电子杂志, 2017, 2 (46) :171.
　　[17]倪敬轩, 黄欢, 陈桃秀, 等.鱼精蛋白增强抗原诱导早期体液免疫反应的研究[J].中国预防兽医学报, 2018, 40 (4) :342-346.