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生物医学成像中几种荧光纳米材料的运用研究-985毕业论文网
来源：985论文网 添加时间：2019-12-20 14:22
摘 要： 荧光成像是生物医学研究领域应用最广的成像技术之一。随着纳米技术的快速发展，具有优良特性的荧光纳米材料不断涌现。相比于传统的荧光分子，荧光纳米材料具有光学稳定性高、形貌尺寸易调控、多功能化等优点。利用荧光纳米材料作为探针的生物荧光成像能够为研究者提供从细胞、离体组织到活体生物样本的结构和动态信息等方面全面细致的探测方法，成为当前材料、光学、生物医学等多学科交叉领域的研究热点。结合近年来荧光纳米材料及其生物成像应用的发展趋势以及本课题组前期的研究工作基础，归纳概述了几种类型荧光纳米材料的特性，包括基于有机荧光染料的纳米颗粒、半导体量子点、碳基荧光纳米材料以及稀土掺杂上转换发光纳米材料，结合具体例子介绍了荧光纳米材料在生物医学成像中的应用，并对其发展前景进行了展望。
关键词： 荧光纳米材料； 半导体量子点； 碳基量子点； 上转换发光纳米颗粒； 生物成像。
Abstract: Fluorescence imaging is one of the most widely used imaging techniques in biomedical research. Along with therapid development of nanotechnology,different kinds of fluorescent nanomaterials with excellent properties are constantly emer-ging. Compared to traditional fluorescent molecules,fluorescent nanomaterials show many advantages,such as superior photo-stability,tunable morphology and size,as well as multifunction. Fluorescence imaging based on nanomaterials offers a uniqueapproach that can be used to visualize morphological details for bio-species,ranging from living cells to animals,forming amajor thrust in the fields of materials,optics,biomedical and so on. In this article,we will present a focused review on varioustypes of fluorescent nanomaterials,including organic dye doped nanoparticles,semiconductor quantum dots,and fluorescentcarbon nanomaterials. The applications of these nanomaterials in bioimaging will be summarized with examples. We will alsodiscuss some challenges and opportunities for the use of fluorescent nanomaterials in biomedical diagnosis and therapy.
Key words: fluorescent nanomaterials; semiconductor quantum dots; carbon dots; upconversion nanophosphors;bioimaging.
1 前 言。
生物影像信息时生命科学研究中最重要、最直接的研究证据之一，有时甚至是唯一的证据。随着各种先进影像学方法和技术的发展，人们能够获得生命体实时、定量、原位、活体和高灵敏的生物学信息，为现代生命科学研究的快速发展奠定了基础[1].目前生物影像技术如 X 射线、B 超、电子计算机断层扫描（ CT） 、正电子发射型计算机断层显像（ PET） 、磁共振成像（ MRI） 等，存在辐射大、成本高、操作复杂的缺点。光学成像尤其是生物荧光成像因其组织破坏性小、无有害电磁辐射、成像设备成本低等优点，表现出取代上述成像手段的潜力[2].
生物荧光成像是利用生物体荧光特性的变化来获得光学图像。由于在很多生物结构和生物过程中都缺少内源荧光材料，很难利用生物样本的本征荧光进行成像和探测，因此多数情况下需要引入外源荧光材料作为造影剂，对特定细胞或组织器官进行标定[3].荧光蛋白作为一种无损的活细胞荧光标记物，在光学生物成像领域占有举足轻重的地位，为细胞生物学和神经生物学的研究带来了革命性的变化[4].利用荧光蛋白标记与双光子荧光成像、活体荧光成像等技术相结合，能够“看到”生物活体内特定蛋白的表达，原位、动态跟踪细胞内部的分子事件。但是荧光蛋白存在抗光漂白性差、红外吸收和发射荧光蛋白研发困难等问题，制约了荧光蛋白在长时间荧光成像及活体深度成像的应用[5].
荧光纳米材料是具有荧光性质且至少有一维的尺寸处于 1~100 nm 量级的超微小材料[6].在离体细胞层面，荧光纳米材料足够小的尺寸使其能够通过扩散或经内吞进入细胞，作为细胞荧光成像探针； 在活体动物层面，纳米颗粒进入血液循环后，能够从高通透性的肿瘤血管渗出并在肿瘤部位富集，作为肿瘤诊断的探针。另外，通过纳米技术将荧光材料与治疗药物相结合，开发具有靶向性、多功能的诊疗一体化纳米颗粒，为疾病的早期检测和更加有效的治疗提供了新的技术手段[7].
近年来，荧光纳米材料及其生物医学成像研究已成为新材料领域科研工作者关注的热点。本文结合我们前期的研究工作基础，归纳概述了几种类型荧光纳米材料，包括基于有机荧光染料的纳米颗粒、半导体量子点、碳基荧光纳米材料以及稀土掺杂上转换发光纳米材料，结合具体例子介绍了荧光纳米材料在生物医学成像中的应用，并对这些材料的发展前景进行了展望。
2 基于有机荧光染料的纳米颗粒。
有机荧光染料，包括荧光素类以及罗丹明类染料，是目前生物医学研究中最常用的荧光探针。以有机荧光材料作为荧光剂的荧光纳米颗粒制备主要有两种方式，一种是利用有机聚合物或者无机纳米颗粒把有机染料分子包裹到纳米颗粒内部[8-10],一种是通过化学或者物理的方法使有机染料分子吸附在纳米颗粒的表面[11,12].将有机染料分子同纳米颗粒相结合，能够提高染料分子在生物体环境的稳定性，防止有机染料分子在生物组织内的扩散[8].另外通过表面修饰在纳米颗粒表面连接蛋白或者生物分子，能够实现对细胞及活体肿瘤组织的特异性生物标记与荧光成像[9].图 1 展示了钱骏等[8]利用二氧化硅纳米颗粒包覆有机荧光分子（ PpIX） 的过程示意图。包裹有荧光染料分子的二氧化硅纳米颗粒（ PpIX@SiO2） 平均尺寸为 25 nm,在水中具有良好的分散性，适于用作离体细胞和活体成像的纳米探针。我们利用对PpIX@ SiO2纳米探针与 HeLa 细胞共同孵育，随后采用双光子荧光显微镜对细胞进行观察，结构表明在波长为800 nm 的飞秒激光激发下，细胞内部能够观察到 PpIX分子的双光子荧光信号，表明该荧光纳米颗粒能够进入细胞内部，可以用作细胞标记和荧光成像的探针。
![【图 1 （ a） 用二氧化硅纳米小球包覆 PpIX 的反应流程示意图；（ b） PpIX@ SiO2纳米颗粒的 TEM 照片； （ c） PpIX@ SiO2纳米颗粒在波长为 400 nm 的连续激光激发（ 1-photonexcited） 和波长为 800 nm 的飞秒激光激发（ 2-photonexcited） 下的荧光光谱曲线； 双光子激发的细胞荧光成像（ d） 不作任何处理的对照组 HeLa 细胞，（ e） 同 PpIX@ SiO2纳米颗粒共同孵育 2 h 后的 HeLa 细胞（ 插图： 细胞内荧光信号的光谱曲线）[8]Fig. 1 （ a） Synthesis illustration of PpIX@ SiO2nanoparticles,（ b） a typical TEM image of PpIX@ SiO2nanoparticles,（ c） one-and two-photon excited fluorescence spectraof PpIX@ SiO2nanoparticles,two-photon excitedfluorescence images of HeLa cells treated （ d） withoutand （ e） with PpIX@ SiO2nanoparticles （ insert:fluorescence spectra in cells）[8]】](/uploads/allimg/191220/1423252000-0.png)
关键词： 荧光纳米材料； 半导体量子点； 碳基量子点； 上转换发光纳米颗粒； 生物成像。
Abstract: Fluorescence imaging is one of the most widely used imaging techniques in biomedical research. Along with therapid development of nanotechnology,different kinds of fluorescent nanomaterials with excellent properties are constantly emer-ging. Compared to traditional fluorescent molecules,fluorescent nanomaterials show many advantages,such as superior photo-stability,tunable morphology and size,as well as multifunction. Fluorescence imaging based on nanomaterials offers a uniqueapproach that can be used to visualize morphological details for bio-species,ranging from living cells to animals,forming amajor thrust in the fields of materials,optics,biomedical and so on. In this article,we will present a focused review on varioustypes of fluorescent nanomaterials,including organic dye doped nanoparticles,semiconductor quantum dots,and fluorescentcarbon nanomaterials. The applications of these nanomaterials in bioimaging will be summarized with examples. We will alsodiscuss some challenges and opportunities for the use of fluorescent nanomaterials in biomedical diagnosis and therapy.
Key words: fluorescent nanomaterials; semiconductor quantum dots; carbon dots; upconversion nanophosphors;bioimaging.
1 前 言。
生物影像信息时生命科学研究中最重要、最直接的研究证据之一，有时甚至是唯一的证据。随着各种先进影像学方法和技术的发展，人们能够获得生命体实时、定量、原位、活体和高灵敏的生物学信息，为现代生命科学研究的快速发展奠定了基础[1].目前生物影像技术如 X 射线、B 超、电子计算机断层扫描（ CT） 、正电子发射型计算机断层显像（ PET） 、磁共振成像（ MRI） 等，存在辐射大、成本高、操作复杂的缺点。光学成像尤其是生物荧光成像因其组织破坏性小、无有害电磁辐射、成像设备成本低等优点，表现出取代上述成像手段的潜力[2].
生物荧光成像是利用生物体荧光特性的变化来获得光学图像。由于在很多生物结构和生物过程中都缺少内源荧光材料，很难利用生物样本的本征荧光进行成像和探测，因此多数情况下需要引入外源荧光材料作为造影剂，对特定细胞或组织器官进行标定[3].荧光蛋白作为一种无损的活细胞荧光标记物，在光学生物成像领域占有举足轻重的地位，为细胞生物学和神经生物学的研究带来了革命性的变化[4].利用荧光蛋白标记与双光子荧光成像、活体荧光成像等技术相结合，能够“看到”生物活体内特定蛋白的表达，原位、动态跟踪细胞内部的分子事件。但是荧光蛋白存在抗光漂白性差、红外吸收和发射荧光蛋白研发困难等问题，制约了荧光蛋白在长时间荧光成像及活体深度成像的应用[5].
荧光纳米材料是具有荧光性质且至少有一维的尺寸处于 1~100 nm 量级的超微小材料[6].在离体细胞层面，荧光纳米材料足够小的尺寸使其能够通过扩散或经内吞进入细胞，作为细胞荧光成像探针； 在活体动物层面，纳米颗粒进入血液循环后，能够从高通透性的肿瘤血管渗出并在肿瘤部位富集，作为肿瘤诊断的探针。另外，通过纳米技术将荧光材料与治疗药物相结合，开发具有靶向性、多功能的诊疗一体化纳米颗粒，为疾病的早期检测和更加有效的治疗提供了新的技术手段[7].
近年来，荧光纳米材料及其生物医学成像研究已成为新材料领域科研工作者关注的热点。本文结合我们前期的研究工作基础，归纳概述了几种类型荧光纳米材料，包括基于有机荧光染料的纳米颗粒、半导体量子点、碳基荧光纳米材料以及稀土掺杂上转换发光纳米材料，结合具体例子介绍了荧光纳米材料在生物医学成像中的应用，并对这些材料的发展前景进行了展望。
2 基于有机荧光染料的纳米颗粒。
有机荧光染料，包括荧光素类以及罗丹明类染料，是目前生物医学研究中最常用的荧光探针。以有机荧光材料作为荧光剂的荧光纳米颗粒制备主要有两种方式，一种是利用有机聚合物或者无机纳米颗粒把有机染料分子包裹到纳米颗粒内部[8-10],一种是通过化学或者物理的方法使有机染料分子吸附在纳米颗粒的表面[11,12].将有机染料分子同纳米颗粒相结合，能够提高染料分子在生物体环境的稳定性，防止有机染料分子在生物组织内的扩散[8].另外通过表面修饰在纳米颗粒表面连接蛋白或者生物分子，能够实现对细胞及活体肿瘤组织的特异性生物标记与荧光成像[9].图 1 展示了钱骏等[8]利用二氧化硅纳米颗粒包覆有机荧光分子（ PpIX） 的过程示意图。包裹有荧光染料分子的二氧化硅纳米颗粒（ PpIX@SiO2） 平均尺寸为 25 nm,在水中具有良好的分散性，适于用作离体细胞和活体成像的纳米探针。我们利用对PpIX@ SiO2纳米探针与 HeLa 细胞共同孵育，随后采用双光子荧光显微镜对细胞进行观察，结构表明在波长为800 nm 的飞秒激光激发下，细胞内部能够观察到 PpIX分子的双光子荧光信号，表明该荧光纳米颗粒能够进入细胞内部，可以用作细胞标记和荧光成像的探针。
理想情况下，利用纳米颗粒包覆有机荧光染料分子，纳米颗粒中包覆的染料分子越多，颗粒的荧光效率越高。实际情况是传统有机荧光染料分子是具有大π 共轭体系的刚性平面分子，在稀溶液中能够发射很强的荧光，而在高浓度溶液或聚集状态下，强烈的分子间相互作用产生大量的非辐射失活，使得有机染料分子的荧光强度大幅度降低，即聚集导致荧光猝灭。2001 年，香港科技大学唐本忠院士团队发现硅杂环戊二烯（ Silole） 衍生物在稀溶液中基本没有发光，而在聚集态时呈现非常明亮的荧光发射，即聚集诱导发光（ Aggregation Induced Emission,AIE）[13].AIE材料具有特殊的分子结构，能够在很大程度上减小分子间相互作用，同时大幅限制荧光染料分子在聚集态时的分子内转动，有效地抑制单分子的非辐射失活过程，使其在固态或聚集状态下的荧光强度远远大于其在稀溶液中的荧光强度[14].本课题组[9]利用一种双亲性聚合物 mPEG-DSPE包裹一种疏水性的 AIE 材料（ 分子式简称为 StCN） ,制备了具有荧光特性的纳米胶束（ StCN@ PEG） ,该纳米胶束能够很好地分散在水溶液中，且具有较高的稳定性（ 如图2） .光谱分析结果表明，用纳米颗粒对 AIE 材料进行高浓度的包覆不会引起荧光猝灭，反而会促使荧光效率的增强； 动物实验表明该荧光纳米胶束能够在肿瘤部位富集，用于肿瘤活体荧光成像的探针。另外，我们将能够与肿瘤细胞特异性结合的多肽修饰在纳米胶束表面，用于提高StCN@ PEG 纳米胶束在肿瘤部位富集的效率，实现靶向的肿瘤组织标记和荧光成像诊断。
![【图 2 （ a） StCN@ PEG 纳米胶束制备流程图； （ b） StCN@ PEG 纳米胶束 TEM 照片； （ c） 尾静脉注射 StCN@ PEG 纳米探针后活体小鼠肿瘤荧光成像诊断[9]Fig. 2 （ a） A schematic illustration for the preparation of StCN@ PEG nanomicelles,（ b） a representative TEM image of StCN@ PEGnanomicelles,and （ c） in vivo imaging of mice bearing subcutaneous lung tumor xenografts,injected with StCN@ PEG nanomicelles[9]】](/uploads/allimg/191220/1423254560-1.png)
AIE 材料独特的性质使其成为近年来的研究热点，目前已经开发出能够覆盖可见光波段的 AIE 荧光分子，利用 AIE 材料制备的荧光纳米粒子，已被应用于细胞成像、前哨淋巴结定位、活体肿瘤诊断、活体血管荧光成像等多项生物医学研究[15 -17].在活体荧光反射成像中，生物组织对光的散射和吸收影响着荧光物质的激发效率以及信号采集。由于生物组织在可见光波段的吸收和散射均比较明显，因此利用可见光波段的荧光探针难以实现较深层组织的成像。开发高效的具有近红外荧光激发和发射的 AIE 材料，对于实现深层组织和高对比度的活体荧光成像具有非常重要的意义[17].
3 半导体量子点。
半导体量子点通常是由 II-VI 族或 III-V 族元素组成的纳米颗粒，粒径一般介于 1~10 nm 之间，由于其尺寸小于或者接近激子波尔半径，材料内部的电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光[18].量子点的荧光发射取决于导带与价带间的能带间隙，当量子点尺寸减小时，能带带隙能量会增多大，其吸收和发射波长向短波方向偏移，因此量子点的荧光发射波长可以通过选择适当的尺寸进行调节[18].通过选择适当的材料（ 如 CdS、CdSe、CdTe、Ag2S、PbS、PbSe 等） 制备适当尺寸的纳米晶体，可以获得荧光发射谱覆盖范围相当宽的系列量子点纳米材料（ 如图3）[19].
3 半导体量子点。
半导体量子点通常是由 II-VI 族或 III-V 族元素组成的纳米颗粒，粒径一般介于 1~10 nm 之间，由于其尺寸小于或者接近激子波尔半径，材料内部的电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光[18].量子点的荧光发射取决于导带与价带间的能带间隙，当量子点尺寸减小时，能带带隙能量会增多大，其吸收和发射波长向短波方向偏移，因此量子点的荧光发射波长可以通过选择适当的尺寸进行调节[18].通过选择适当的材料（ 如 CdS、CdSe、CdTe、Ag2S、PbS、PbSe 等） 制备适当尺寸的纳米晶体，可以获得荧光发射谱覆盖范围相当宽的系列量子点纳米材料（ 如图3）[19].
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