BTF3对卵巢癌SKOV3细胞生长增殖的作用分析

摘要  目的：检测通用转录因子3（BTF3）在卵巢癌生长增殖中的作用，探讨其作为治疗靶点的可行性。方法：构建shBTF3慢病毒载体后转染人卵巢癌SKOV3细胞，采用细胞成像仪检测细胞生长状况，流式细胞术检测细胞周期及凋亡率，MTT法检测慢病毒转染后SKOV3细胞增殖状态的改变。结果：shBTF3慢病毒载体成功转染SK-OV3细胞后，与对照组相比，实验组细胞生长状况下降，增殖减慢。SKOV3细胞周期G1期被抑制，细胞凋亡率升高（P<0.05）。结论：BTF3对卵巢癌细胞SKOV3的生长增殖具有促进作用，考虑BTF3基因在卵巢癌中的表达可能与其发生发展及分级分期密切相关。
　　
　　关键词  卵巢癌；通用转录因子3;慢病毒；细胞增殖。
　　
　　卵巢癌由于缺乏早期诊断指标，浸润转移早，化疗敏感性较低，一直高居妇科恶性肿瘤病死率之首，尽管经过了积极而彻底的肿瘤细胞减灭术和联合化疗的应用，患者的5年生存率仍低于40%[1].目前，导致卵巢癌生物学行为的分子机制尚不清楚，但是肿瘤细胞的恶性增殖是绝大部分肿瘤细胞恶性生物学行为的关键步骤。故而，探索卵巢癌早期诊断的分子标记物，尤其是与肿瘤细胞生长增殖及凋亡相关的分子标记物，成为了现如今卵巢癌治疗中亟待解决的问题。随着基因组学与蛋白质组学研究的逐渐深入，现已发现诸多新型的可用于卵巢癌诊断的分子标记物，转录因子即是其中的一类蛋白。有研究表明，转录因子的药理和基因组调节可能被用于生殖过程的控制和治疗卵巢疾病。基于此有必要研究基本转录因子与卵巢癌细胞的关系。
　　
　　通用转录因子3（basic transcription factor 3,BTF3）为普遍性转录因子中的一员，能够与RNA聚合酶Ⅱ相结合，作为基因转录起始复合的一部分。大多数关于BTF3的研究主要围绕生物体或植物，认为BTF3能够导致烟草叶片发黄、形态异常[2],影响小麦的生存率[3].进一步的研究发现，BTF3除了与基因的转录调控密切相关，同时在诸多细胞中参与细胞凋亡的进程，并且对于细胞的生长发育和形态建成均有影响[4].现如今，越来越多的研究发现BTF3在肿瘤细胞中起着抗凋亡的作用，然而这些研究多局限于消化系统或神经内分泌系统肿瘤[5-8],对BTF3与其他基因或信号通路的相互作用机制仍不清楚。故而，本研究构建了shBTF3慢病毒转染人卵巢癌SKOV3细胞，通过研究BTF3对SKOV3细胞增殖、凋亡的影响，进一步探索其在卵巢癌生长增殖中的意义。
　　
　　1材料与方法

      1.1材料DMEM高糖培养基（美国Gibco）；卵巢癌细胞系SKOV3为本实验室保存；Trizol购自于上海普飞公司；RNA逆转录使用Promega M-MLV试剂盒；逆转录引物、MicroRNA PCR引物购自广州市锐博生物科技有限公 司；GV115载 体，AgeⅠ/EcoRⅠ酶切，购自上海吉凯基因化学技术有限公司；质粒抽提试剂盒购于Qiangen公司。
　　
　　1.2 SKOV3细胞培养与传代复苏的SKOV3细胞系使用10%FBS完全培养基培养，置于37℃5%CO2恒温培养箱中培养，待细胞80%-90%融合时，传代培养。
　　
　　1.3 BTF3慢病毒载体的转染与表达获取BTF3序列后，通过载体酶切、目的基因扩增、构建重组质粒，随后将测序结果对比正确的克隆进行质粒抽提。
　　
　　利用限制性内切酶消化获得线性化载体。以线性化载体和退火产物配制反应体系，将线性载体与设计引物进行连接反应，产物直接进行转化。将正确克隆菌液扩大培养、抽提用于下游病毒包装。将携带目的基因或靶点序列的工具载体质粒GV115、病毒包装辅助质粒（Helper 1.0）、病毒包装辅助质粒（Helper 2.0）共转染293T细胞，在转染完成后的48-72h收取未纯化的细胞上清液，采用相应的浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，并测定慢病毒滴度。按照预实验确定的感染条件，使用感染液将SKOV3细胞制成 （3-5）×105个/ml悬液，待培养细胞融合度达30%时，加入最适病毒量感染，8-12h后观察细胞性状，更换培养基后继续培养。感染后72h左右，荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况，荧光率大于80%即为阳性感染率。
　　
　　实验分组为阴性对照病毒感染 （shCtrl）组和shBTF3病毒感染组。各组分别用Trizol RNA提取各组细胞总RNA,用RT-PCR检测各组细胞内BTF3表达程度，评价转染的可靠性。
　　
　　1.4 Celigo细胞成像仪检测细胞生长状态将各组细胞以1 000个细胞/孔种入96孔板进行培养，从铺板后第2天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板3-5d,计算带绿色荧光的细胞的数量，绘出5d的细胞增殖曲线。细胞每组设置3个复孔。
　　
　　1.5流式细胞仪检测细胞周期和凋亡待各实验组6cm培养皿细胞生长至覆盖率约为80%时，胰酶消化后离心获取转染后48h的各组细胞，PBS重悬后70%预冷乙醇置于-20 ℃冰箱固定过夜。取出后离心，用450μl预冷PBS重悬细胞。分别加入25μl RNase A溶液和PI染液（浓度为1mg/ml），使其终浓度为50μg/ml,37℃避光孵育30min.吹散细胞，400目筛网过滤后加入流式管中，上机检测细胞周期。
　　
　　细胞凋亡检测采用Annexin V-FITC/PI试剂盒。消化细胞后收集细胞，离心后用400μl预冷的PBS重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC,轻轻混匀后2-8℃避光孵育15min.随后加入10μl PI染液，轻轻混匀后2-8℃避光孵育5min.在1h内上机检测细胞凋亡情况。
　　
　　1.6 MTT检测慢病毒转染SKOV3细胞后的增殖状态取对数生长期的各组细胞，胰酶消化后以100μl/孔接种于96孔板，每孔约3 000个细胞。从铺板后第2天开始，连续检测5d.培养终止前4h加入20μl 5mg/mL MTT于孔中，随后加入150μl DM-SO,于酶标仪490nm处检测各孔OD值，分析数据。每组设置3-5个复孔。
　　
　　2结果

       2.1 BTF3慢病毒感染SKOV3细胞后表达情况将成功构建的shBTF3慢病毒载体转染入SKOV3后，RT-PCR检测各组BTF3含量显示，实验组（sh-BTF3）SKOV3细胞中BTF3基因在mRNA水平的表达量明显低于对照组（shCtrl）（P<0.05），敲减效率达到94.4%（图1）。Western Blot检测细胞中目的基因 敲 减 后 蛋 白 表 达 量，结 果 显 示shBTF3组SKOV3细胞中，BTF3蛋白水平较对照组显着降低，说明敲减作用有效（图2）。
　　

2.2细胞成像分析慢病毒转染后SKOV3细胞增殖情况将成功构建的shBTF3慢病毒载体转染入SKOV3后，用Celigo细胞成像仪连续检测5d.结果发现实验组SK-OV-3细胞的增殖速率受到显着抑制（图3），shBTF3组细胞与shCtrl组相比，增殖抑制明显，说明BTF3基因与SKOV3细胞的增殖能力显着相关。
　　

　　
       2.3流式细胞仪检测慢病毒转染后SKOV3细胞周期及凋亡情况shBTF3慢病毒成功感染5d后，对各组细胞分别进行检测。流式细胞仪对各组细胞周期分析显示，实验组处于G1期的细胞比例显着减少，处于S期的细胞显着增多，处于G2期的细胞无显着变化，故而提示BTF3基因与SKOV3细胞的周期分布显着相关，shBTF3能够抑制SKOV3细胞周期于G1期（P<0.05,图4）。流式细胞仪检测慢病毒转染后SKOV3细胞凋亡情况显示，与对照组相比，实验组发生凋亡的SKOV3细胞显着增加（P<0.05），故而提示BTF3基因能够促进SKOV3细胞的凋亡（图5）。
　　
　　2.4 MTT检测慢病毒转染后SKOV3细胞增殖情况将成功构建的shBTF3慢病毒载体转染入SK-OV3后，MTT增殖试验检测发现实验组SKOV3细胞的增殖速率受到显着抑制。提示BTF3基因与SKOV3细胞的增殖能力显着相关（图6）。
　　

　　3讨论

       如今，关于BTF3的研究大多是关于生物体或植物的研究，同时也有越来越多的证据显示BTF3的表达与许多肿瘤的发生、发展相关。Wang[5]等在大肠腺癌中的研究表明，BTF3在肿瘤中的表达较正常组织明显增加；而Odreman[6]等在人脑组织星形细胞瘤中寻找表达异常的基因时，也发现BTF3的表达明显增加。王大维[7]等通过免疫组织化学法测定结果表明食管鳞状细胞癌中BTF3表达明显高于正常组织。有研究认为，BTF3的表达水平可能对细胞周期检查点、细胞增殖是很重要的，进一步提示可能与人类肿瘤的发生和发展有着潜在的联系[8].
　　
　　即便如此，仍有较少关于BTF3在卵巢癌中作用机制的相关报道。卵巢癌是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一[9],由于其发病隐匿，缺乏有效的早期诊断方法，70%以上的患者初诊时已属晚期，治疗及预后效果极差，致死率居各类妇科恶性肿瘤首位[10].因此，探寻卵巢癌发生发展过程中的关键分子，对于开发卵巢癌靶向治疗药物具有非常重要的意义[11].本研究首先用RT-PCR技术检测证实了BTF3在卵巢癌细胞中呈高丰度表达，揭示了BTF3与卵巢癌细胞之间存在着联系。随后构建目的基因RNA干扰慢病毒载体，RNAi慢病毒克隆制备并包装，以慢病毒感染目的细胞SKOV3.我们分别从细胞成像、细胞周期与凋亡、细胞增殖等方面研究了BTF3对SKOV3细胞增殖与凋亡的影响。发现在BTF3表达受抑制的感染细胞中，细胞增殖被抑制，细胞周期停滞于S期，细胞凋亡加速。从而说明BTF3能够通过抑制SKOV3细胞凋亡，改变各个细胞周期细胞数的分布而促进卵巢癌细胞的增殖。
　　
　　另一方面，卵巢癌的发生是与细胞增殖分化有关的原癌基因、抑癌基因互相作用的结果，它组织学类型复杂，特异性症状和早期诊断手段缺乏，从而导致了高死亡率。现如今，基因治疗成为研究热点，erbB,c-myc,k-ras等癌基因，RB,P53,P16等抑癌基因研究较 为 常 见，PIK3CA、AKT2、MTA1、ATG5等基因研究也有报道。通用转录因子3（BTF3）与上述基因是否存在关联，其可否成为卵巢癌诊断的基因标志物以及其在卵巢癌细胞中更多的生物学作用还需要进一步的研究。
　　
　　本研究揭示了BTF3在卵巢癌细胞中呈现高表达状态，并通过构建shBTF3慢病毒转染SKOV3细胞，表明BTF3对卵巢癌SKOV3细胞的生长增殖具有促进作用，考虑BTF3基因在卵巢癌中的表达可能与其发生发展及分级分期密切相关。然而其抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的具体机制目前尚不明确。未来进一步研究BTF3基因在恶性肿瘤中的表达量变化、影响因素、与其他因素的相互作用等，必将为恶性肿瘤的预防、诊断和预后评估提供更大的帮助。
　　
　　参考文献

[1]Baldwin LA,Huang B,Miller RW,et al.Ten-year rel-ative survival for epithelial ovarian cancer[J].ObstetGynecol,2012,120（3）:612-618.
[2]Yang KS,Kim HS,Jin UH,et al.Silencing of NbBTF3results in developmental defects and disturbed gene ex-pression in chloroplasts and mitochondria of higherplants[J].Planta,2007,225:1 459-1 469