生物技术论文：三维细胞培养综述及在肿瘤药理学研究中的应用

      摘要：三维细胞培养 (Three-Dimensional Cell Culture, TDCC) 允许体外肿瘤细胞在各个方向上生长, 可以在细胞基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面更好地模拟体内细胞状态。TDCC既保留体内细胞的形态, 又体现细胞培养的直观性及条件可控性, 为进一步研究肿瘤细胞特征提供了良好的平台, 特别是在转化医学、药敏研究等关键领域。TDCC将传统2D细胞培养与动物实验模型相结合, 取精用宏, 为推进肿瘤细胞生物学研究发挥举足轻重的作用。本文着重论述TDCC技术在医学研究中的应用, 包括肿瘤药理学、干细胞和类器官模型的临床应用及生命科学研究领域的应用, 为临床及基础研究工作者提供理论依据与参考。

 

　　关键词：三维细胞培养 (TDCC) ; 药理学; 干细胞; 临床应用; 细胞外基质;

 

　　Development of Three-Dimensional Cell Culture and Its Application in Medical Research

 

　　YU Kun ZHOU Yongchun

 

　　Molecular Diagnostic Center of The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University (Yunnan Cancer Hospital)

 

　　Abstract：Three-Dimensional Cell Culture (TDCC) technology is a technique between single-layer cell culture and animal experiments. It can not only simulate the internal environment to the greatest extent, but also demonstrate the intuitiveness and conditions of cell culture. TDCC not only retains the morphology of cells in vivo, but also embodies the visualization and condition controllability of cell culture, which provides a good platform for further study on the characteristics of tumor cells, especially in the key fields of transformation medicine, drug sensitivity research and so on. TDCC combines the traditional 2D cell culture with the animal experimental model, which is very important for promoting the study of tumor cell biology. This article focuses on the application of TDCC technology in medical research, including oncology pharmacology, clinical application of stem cell and organoid model and application in life science research, aims to provide theoretical basis and reference for clinical and basic research workers.

 

　　1 三维细胞培养的前世今生

 

　　细胞培养技术的萌芽可以追溯至1885年, 德国科学家Willhelm Roux成功分离鸡胚细胞并用盐水培养数日[1,2]。1943年, Earle等创建了单层细胞培养法, 首次创建长期传代的L-细胞系, 五年后, Sanford使用细胞分离培养法获纯L-细胞系[3]。随着双抗、胰蛋白酶的应用, 体外细胞培养技术日升月恒, 具有易操作、成本低等优点, 细胞在很长一段时间内可以无限增殖和分化, 但其生长发育的环境和条件与体内差异较大, 这就导致细胞的基因表达和形态特征与体内差异较大, 得出的实验结果并不能一一在动物体内得到重复。上世纪80年代, Weaver等对细胞与ECM间的关系进行了系统性总结, 在对乳腺癌细胞的研究中构建出TDCC模型, 并观察到单层管状腺泡样结构的正常乳腺上皮细胞及腺泡结构的碗状的癌变上皮细胞[4], 三维培养技术运势而生, 正式登上历史的舞台, 崭露头角。本世纪初Jacks和Weinberg[5]和Abbott[6]发表了使用Matrigel TM与海绵凝胶混合基质进行组织培养, 形成了疑似三维构造的细胞团。同年, Amann团队[7]描述了使用非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞系与肺成纤维细胞组合的新型3D共培养模型。通过对比研究, 证明了该模型更接近体内细胞生长微环境, 能更好地反映肿瘤-基质相互作用。Young等[8]总结了前人的经验, 借组织辊 (TRACER) 平台 (生成的生物复合材料卷绕在心轴周围以产生3D和分层结构) 将癌症相关成纤维细胞 (CAF) 和下咽鳞状细胞 (FaDu) 细胞进行共培养, 发现在培养物的24和48 h确实产生了增殖速率和侵袭性细胞迁移的增加。为研究肿瘤-基质相互作用以及新型TDCC模式提供了基础。近年肿瘤基础实验研究中, TDCC技术已得到越来越多的关注。

 

　　2在肿瘤药理学研究中的应用

 

　　Souza团队[9]利用2D和磁性3D生物打印系统培养并用抗肿瘤药物紫杉醇和多西紫杉醇评估了前列腺肿瘤细胞系PC-3, LNCaP和DU145的增殖、基因表达、化学抗性和细胞毒性差异, TDCC物显示出较低的细胞增殖率, 对紫杉醇和多西紫杉醇更大的抗性以及发生了基因表达谱的改变。

 

　　药物诱导的肝损伤是制药工业中与安全相关的磨损的主要原因。研究者们也在不断突破肝细胞系和原代肝细胞这些2D肝脏模型的局限性, 继续寻找更切合体内实际的体外模型。3D肝脏模型的出现, 包括球状体, 3D生物打印的肝脏和肝脏上芯片, 彻底改变了体外肝脏毒性测试。这些模型被统称为微生理系统 (MPS) 。该模型可以在培养物中维持至少1个月, 在此期间保持显著的药物代谢能力。一些MPS模型也可以与其他非实质支持细胞共培养, 例如内皮细胞, 库普弗细胞和星状细胞, 这增加了毒性评估模型的多功能性。TDCC表现出与体内系统更相似的行为, 是新药研发最有前途、更为可靠的工具。

 

 

　　3 干细胞和类器官模型的临床应用

 

　　具有广泛来源和多能分化的人多能干细胞 (hPSCs) 被认为是组织修复和重建领域的后起之秀。然而, 传统的贴壁培养改变了hPSCs的初始生长环境, 导致自我分化、衰退、形态学甚至基因表达等改变, 三维球体培养在促进hPSCs的生物活性中起着重要作用。Nachlas等[10]用透明质酸和聚N-异丙基丙烯酰胺组成的热响应性3D水凝胶对hPSCs进行培养, 这种具有调节化学和机械性质能力的系统易于在低温下与细胞混合, 在37℃时在水凝胶内进行物理包封, 保持细胞多能性, 其分化增殖能力得到加强。Sasagawa团队[11]试图使用脐带血衍生的内皮祖细胞的亚型, 具有强烈的增殖和血管生成潜力的内皮细胞集落形成细胞 (ECFC) 制造血管前体, 并评估这些构建体的体内血管生成潜力。人脐带血管内皮细胞 (HUVEC) 也用于与ECFC比较, ECFC使用纤维蛋白包被的细胞片操纵器夹在衍生的成纤维细胞 (FB) 片之间。将双层FB片中插入的ECFC培养3 d, 导致形成与HUVEC类似的网络结构。另外, 当ECFC夹在3个FB片材中时, 在共培养后3 d在3层细胞片构建体中发现了管腔结构。将含有ECFC的这些构建体移植到免疫缺陷大鼠的皮下组织中, 1周后, 与HUVEC阳性移植物相同的方式观察含有大鼠红细胞的ECFC的功能性微血管, 表明ECFC可能成为3D细胞密集组织构建体中制造血管前结构的替代细胞来源而在临床得到广泛应用。

 

　　4 生命科学研究领域的应用

 

　　业已证实, 3D培养的细胞比二维贴壁细胞具有更多的生理学相关功能。随着肿瘤与其微环境之间相互作用的复杂性变得越来越明显, 迫切需要设计能够真实地概括3D微环境和相关细胞群的体外模型。细胞在复杂的体内微环境中被细胞外基质 (ECM) 三维包裹, 并与ECM和相邻细胞相互作用。因此, 复制ECM环境是细胞培养模型成功的关键。已有多项研究基于物理、化学和生物特征 (例如生物相容性, 生物可降解性和生物化学官能团) 使用各种天然和合成水凝胶来模拟ECM环境, 由于这些特性, 水凝胶可与微流控技术结合并在芯片上构建3D系统, 同时可控制所选水凝胶的孔隙率以促进营养素和氧气的移动, 近乎完美地模拟了体内微环境[12]。

 

　　骨肉瘤 (OS) 是最常见的骨原发性恶性肿瘤, 优先发生肺转移。尽管标准化疗在过去几十年中显着改善了长期存活率, 但转移性或复发性OS患者的预后仍然非常差。因此, 需要新的疗法来减缓进展并根除疾病。此外, 为了更好地理解导致OS发作和进展的细胞和分子机制, 亟待开发类似于天然三维肿瘤微环境的新型培养系统。Angela等[13]总结了TDCC的最新技术, 并报告所取得的成果, 突出了这些模型在再现肿瘤环境中的功效, 其中建立的3D OS球体模型被认为是肿瘤研究中最具生理学相关性的三维模型[14]。然而, 由于材料的选择, 制造工艺以及需要同时支持硬组织和软组织和多种细胞群的最佳条件, 使得骨肿瘤3D建模仍然是一项艰难的尝试。

 

　　5 结论与展望

 

　　当下, TDCC作为一项新兴的细胞培养技术, 已从单纯的悬浮成球演变到微流控、芯片、组织工程支架和3D打印培养, 无不证明TDCC将在未来临床医学及基础研究中起到扮演越来越重要的角色。然而, TDCC尚存一定的局限性:首先, 繁琐的制备步骤及昂贵的成本限制了其推广;其次, 有限的分化程度和生存能力阻碍了TDCC的发展。因此, 我们应积极采取措施, (1) 用纳米技术等更高新的材料和加工技术, 让培养系统的各项参数可控可调。 (2) 与不同类型的生物反应器结合, 如与流式生物反应器结合, 来解决三维培养中代谢产物或者药物运动扩散受限的情况; (3) 以此为平台建立多种细胞共培养体系, 如肿瘤细胞+免疫细胞+内皮细胞共培养等, 以明确肿瘤细胞与基质及其他相邻细胞之间同时作用的影响。为此, 未来TDCC技术的发展需要医学, 生物科学、材料和高分子化学、物理学、仪器制造业等许多领域的跨学科协作发展, 以上这些都将更好地模拟体内肿瘤细胞真实的微环境情况, 有助于我们得出更准确的科学结论, 助力精准医疗。