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近期色谱-质谱相关技术和方法学研究综述

来源:985论文网 添加时间:2019-12-20 14:35
本文对近期色谱-质谱相关技术和方法学研究进展进行简略评述。由于色谱方法研究和应用领域十分广泛,涉及方方面面,本文仅简要介绍色谱、多维色谱及其与质谱联用技术在生物物质分析领域(主要是人类染色体蛋白质组、糖蛋白、磷酸化蛋白质组)的研究工作,此外还包括体积排阻色谱分离病毒颗粒、量子点、肝素方面的研究和多维气相色谱分析进展及其他亮点文章。
  
  最近有专辑[1]报道了人类染色体蛋白质组的研究。人类染色体蛋白组计划(CHPP)的目标瞄准人类基因组编码的 19 467 个蛋白质,鉴定其中尽可能多的蛋白质。从过去的 4 年来看,该蛋白质组计划获得的蛋白质数据从 2013 年的 13 664 个逐年增加到 2016 年的16 537个高置信度蛋白质。该数据经过了严格的人类蛋白质组计划质谱数据解析标准(2. 14 版)的验证。人类基因组预测的蛋白质中,85% 已得到质谱和多重方法的确认,那些还没有得到验证的丢失蛋白质(missing proteins)仍然在持续发现之中,其中 2 663 个丢失蛋白质的线索正在通过国际数据库 PeptidesAtlas 重新分析。
  
  糖蛋白有重要作用,例如改变蛋白质功能、调节蛋白质相互作用和蛋白质周转率,而糖链结构与疾病的发生、发展密切相关,其中非正常序列结构是疾病或癌症的关键标志物。Zhou 等[2]发展了糖蛋白的定量标记新方法,采用 aminoxy TMT(aminoxytandem mass tag)标记试剂,同时编码标记定量 6种糖链结构的糖蛋白,用 0. 2 mol/ L NaCl 溶液显着增强钠加合物的离子化效率。经过色谱分离与质谱条件的优化,作者分离检测了血清中的少量 N-糖链,确定了该方法在食管疾病中的诊断作用。
  
  相对分子质量较大的多肽鉴定一直是一项困难的工作,由于其不能酶解、电荷少,鉴定比较困难。近期,Lin 等[3]报道了一种纳流高效液相色谱-质谱分析方法,分离鉴定高相对分子质量的糖肽。该方法发展了一种超强离子化试剂硝基苄醇(m-NBA),将其加入流动相中可显着增强相对分子质量较大的,特别是酸性糖基化肽的电离效果。含有唾液酸的糖肽提高效果尤其明显。通过对生物工程在大肠杆菌中表达的糖蛋白的分析,鉴定到的糖肽含有 98个单糖的糖链结构。验证了反相液相色谱流动相中添加 m-NBA 可有效增强糖蛋白的鉴定效果。
  
  Shubhakar 等[4]报道了一种糖链全甲基化的高通量鉴定方法,该方法经过自动化的流程对糖链进行全甲基化处理,平均每分钟完成一个样品的分析。对免疫球蛋白(IgG4)单克隆抗体和重组人红细胞生成素(rhEPO)的分析验证了方法的可靠性。通过亲水作用色谱和超高效液相色谱分析验证了方法的准确性,其有望在药物筛选和临床标志物研究等方面获得应用。
  
  Tanabe 等[5]开展了多岩藻糖化蛋白与肝癌的相关性研究。研究发现早期的肝癌不仅与甲胎蛋白(AFP)的异常升高相关,还与多岩藻糖化的 α-1-酸糖蛋白有密切关系。对 27 例乙肝、26 例丙肝、27 例健康志愿者血液中的糖蛋白组进行分析,采用超滤和凝集素亲和色谱处理、色谱-质谱分离鉴定,在 3万多糖肽中筛选出了 α-1-酸糖蛋白分子,该分子具有多个岩藻糖结构和四天线结构,在乙肝和丙肝导致的肝癌病人的血液样本中异常升高。
  
  Karner 等[6]研究了黏膜炎莫拉菌,它通过膜蛋白黏附在人的呼吸道上皮细胞上,感染形成慢性阻塞性肺病和急性中耳炎等疾病。作者采用碳酸钠溶液提取外层质膜泡囊,通过纳流液相色谱、多维色谱-质谱进行分离鉴定。氨基葡萄糖糖苷(GAGs)在侵入人体细胞时发挥着关键作用,作者重点对GAGs 亲和的膜蛋白组进行了研究,发现了潜在的抗原蛋白组和疫苗结合蛋白质。同时,还发现了一批新的潜在免疫抗原蛋白质。
  
  磷酸化蛋白在生命调控过程中的作用非常广泛,其分离鉴定研究仍然十分活跃。Zarei等[7]研究发展了基于静电排斥-亲水作用色谱(ERLIC)分离磷酸化肽的新方法。第一步,多磷酸化肽根据其负电荷多少在离子排斥-亲水作用模式下依次分离;第二步,强阳离子交换(SCX)色谱再次分离单磷酸化肽。鉴于 SCX 色谱的交换能力较强,可以分离那些单磷酸化肽和少数负电荷少的肽,使各种磷酸化肽组分得到更完全的分离和鉴定。该方法还可以通过固相萃取柱在 2 h 内实现馏分化分级。
  
  盐和 pH 是目前离子交换色谱的主要淋洗方式,Adachi 等[8]研究开发了一种酸梯度洗脱分离磷酸化肽的新方法。作者采用 C18-SCX StageTip 为分离介质,分别对比了酸和盐梯度洗脱的效果。实验表明,采用酸梯度洗脱能从 2 mg 样品中分离鉴定到 22 000 个磷酸化肽,比传统方法获得更多的蛋白质鉴定结果,而且方法简单、成本低、易自动化、无需复杂的技术设备。
  
  与蛋白质组研究密切相关的、多维色谱分离基础上的蛋白质谱检测定量技术得到不断发展。Ruedi Aebersold 研 究 组[9]发 展 了 SWATH-MS(sequential windowed acquisition of all theoreti-cal fragment ion mass spectra)技术,大幅提高了蛋白组分析的通量和重复性。近期,他们[9]又推出了用于蛋白质组定量的 TRIC(Transfer of Identifi-cation Confidence)软件技术。通过质谱碎片离子数据构建交叉校正方法,采用连续峰提取定量获得更加准确的定量结果。TRIC 技术能够得到更加精确的数据,校正点不超过 3 个即可解决色谱出峰过程中的浓度非均匀性问题。人诱导干细胞的蛋白组分析结果表明,不经校正即可自动分析、定量轻/ 重同位素标记的不同蛋白质组中数千种蛋白质峰对。
  
  在定量蛋白质组研究方面的常用定量软件MaxQuant 近期又有新的技术升级[10],其中包括提供不同定量方法、控制最小假阳性率(FDRs),以及翻译后修饰(PTMs)分析等功能。该软件可以网上免费获取(http:// www.maxquant.org)。

体积排阻色谱在分离大的生物分子和颗粒物方面具有特殊作用。Vajda 等[11]研究了体积排阻色谱(SEC)分离流感病毒颗粒的新方法。血凝反应检测是广泛用于流感活性检测的方法,但是它不能观察到病毒颗粒大小。SEC 分离基础上的检测便可以获 得 相 关 的 重 要 信 息。流 动 相 中 添 加 200mmol / L 的精氨酸或氯化钠可以获得完全分散的病毒颗粒,柠檬酸钠则可以导致病毒聚集。H1N1 病毒的数量与 DNA 含量在 5 ng/ mL 到 670 ng/ mL 之间有很好的关联度。馏分中病毒含量得到红细胞凝聚活性测定的验证。3 种流感疫 苗 株 (H1N1v5258、H1N1 PR / 8 / 34 和 H3N2 Aichi / 2 / 68)依据病毒颗粒的大小经过 SEC 分离和活性检测,获得了更重要的病毒相关信息。
  
  量子点(QD)纳米材料广泛用于生物分子荧光标记跟踪和细胞成像等。庞代文实验室[12]采用SEC 发展了量子点分离纯化技术。作者采用高效SEC 对辛胺接枝聚丙烯酸修饰的量子点进行分离,将量子点与团聚量子点和聚合物分开;分离后的量子点稳定性大幅增加。随后,作者对量子点、量子点与链霉亲和素(SA)和免疫球蛋白(IgG)分别结合形成复合物 QD-SA 和 QD-IgG 进行分离,并将分离制备的两种复合物用于肿瘤标志物的切片检测,效果非常好,无非特异性吸附现象。该方法对生物探针的制备、分离、纯化有重要的应用价值。
  
  Zaia 等[13]采用体积排阻色谱-离子抑制质谱分离检测了低分子量肝素类化合物的成分。肝素作为重要的治疗药物,一直被广泛应用于治疗凝血功能障碍。随着国际专利过期,应用肝素制备的新药已经获得美国 FDA(Food and Drug Administration)批准。作者发展了针对含有 30 个以内寡糖并具有精确相对分子质量的肝素类化合物单体测定方法,采用离子抑制池除盐,体积排阻色谱馏分直接用电喷雾质谱鉴定,可以圆满解决肝素的分析问题。
  
  全二维气相色谱(GC×GC)技术研究也有不少新进展。Luong 等[14]发展了新的 GC×GC 系统,采用了不依赖温度的调制调节器(TiM)。该系统采用热电制冷和云母制热技术,无需液氮冷冻,增大补充气流可以有效改善色谱操作参数,有利于分别控制第一维和第二维色谱柱达到最佳分离效率。调节再进样效率还有利于第一维色谱的反吹,加快消除柱子的背景干扰。TiM 技术可用于 nC6~ nC24 范围的挥发性化合物的分析。对苯、甲苯、乙苯和二甲苯的测定结果表明,第一维和第二维结果的重复性分别达到 0. 009% 和 0. 008% (n = 10),标准偏差均小于 4. 7%.
  
  Tian 等[15]研究开发了用于 GC×GC/ time offlight (TOF)-MS 的数据处理软件系统(GC2MS)。该系统基于网络平台开发,可以有效利用网上数据信息,特别是代谢组学数据,能获得各种 GC×GC/TOF-MS 质谱图谱数据信息。通过比较图谱的相似性、校正基线获得图谱的关联度。GC2MS 可用于不同条件下人血浆样品中当归中化合物的分析,表明该数据系统具有高效性和实用性。
  
  Zimmermann 实验室[16]采用 GC×GC 技术研究了人呼出气体中的挥发性有机物。利用真空紫外吸收光谱(VUV)检测化合物类型。系统优化了吸收池体积和气体流速,取得了高灵敏度和高分辨率。同时,将 VUV 检测器与 TOF-MS 进行了比较,其峰宽达到 300 ms,检出限达到 ng 以下级别。采用针头捕集微萃取(NTME)采样,测定了人血糖变化过程中呼出气体的组成变化,对临床应用具有重要意义。
  
  在色谱柱制备技术方面,Lincoln 等[17]近期研究了基于两维“柱状”阵列的色谱分离系统。采用多孔二氧化硅层增加比表面积,降低相比,提高色谱保留能力。柱状填料多孔层厚 20~250 nm,采用光刻和等离子增强化学气相沉积法制备,再采用十八烷基三氯硅烷或正丁基二甲基氯硅烷键合反应制备反相表面。理论计算表明,50 nm 厚的多孔层可提高比表面积 120 倍。实际样品的保留测试也表明,随着多孔层厚度的增加,样品的保留显着增大。对荧光衍生的胺类化合物的两维分离验证了该平面色谱的高效分离能力。
  
  Jorgenson 研究组[18]报道了一种超长、超高效毛细管液相色谱柱的匀浆装柱技术。高浓度的填料匀浆液和超声震荡是形成高均一填充床、获得高效柱的途径。作者利用 200 mg/ mL 的 2. 02 微米填料匀浆液填充了6 根长1 m、内径75 μm 的柱子,其中3 根在超声条件下获得了折合塔板高度为 1. 05 的结果。这表明高浓度匀浆填料加超声可以制备超长、超高效毛细管液相色谱柱。
  
  色谱-质谱分析技术还用于研究人的生活习性、活动范围,以及与人群之间的物质交换等。Petras等[19]采用色谱-质谱采集了大量日常生活中接触的环境和物体上残留的化合物样品,以此分析数据用于关联人的生活习惯和各种活动空间、接触物体等。通过对居住的房间、开的车、光顾的饭店、工作的实验室和办公室等环境中接触到的各种化学物质和人体释放的化学物质的分析,可以从人群中描绘出一个人每天的各种习惯和留下的踪迹,得到三维空间模型中各种接触点(如门把手、自行车把手等)和皮肤接触到的物体(如自行车架等)。大约 50% 的化合物来自其他人群和环境中的物质。从中可以发现个人使用的化妆品、塑料用品、清洗剂、食物和食品添加剂,甚至吃的药物等线索。这一研究在法医学、医疗保健、建筑设计、空间探索与环境应用中均有重要价值。
  
  参考文献:
  
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