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Rab29调控细胞内甲状旁腺激素受体转运的机制
来源：985论文网 添加时间：2019-12-20 14:34
摘要：目的研究Rab29在细胞内的分布以及对甲状旁腺激素受体（PTHR）胞内转运的调控作用。方法采用免疫荧光技术观察Rab29在细胞内的分布；细胞内分别转染野生型Rab29和Rab29两种突变型，免疫荧光技术观察3种Rab29在细胞内的分布；细胞内共转染PTHR和Rab29,免疫荧光技术处理后，在电镜下观察Rab29调控PTHR的胞内分布；半衰期实验检测细胞Rab29基因敲减后PTHR的稳定性。结果Rab29定位于反式高尔基体，Rab29突变型的细胞内定位均由野生型的核周聚集变为细胞内弥散状，Rab29的缺陷导致了PTHR的逆膜转运受损和稳定性下降。结论定位于反式高尔基体的Rab29是逆膜转运通路中不可或缺的一部分，对PTHR的胞内转运起着重要的调控作用。
关键词：Rab29;甲状旁腺激素受体；胞内转运；调控。
Abstract:Objective To explore the intracellular distribution of the Rab29as well as the regulation of the Rab29in the intracel-lular trafficking of parathyroid hormone receptor（PTHR）。Methods By immunofluorescence technique,the intracellular distribu-tion of the Rab29was observed.Wild type Rab29and two mutant-types of Rab29were transfected respectively and the intracellulardistributions of the three types of Rab29were observed using immunofluorescence technique.Co-transfection of PTHR and Rab29was constructed in cells,and then the intracellular distribution of the PTHR which was regulated by Rab29with the help of electronmicroscope after immunofluorescence treatment had been observed.Using half-life experiment,the stability of the PTHR was testedafter Rab29was knocked-down.Results Rab29located in trans-Golgi apparatus,and the wild-type Rab29exhibited perinuclear pat-tern while the mutant-types were dispersed in cells,the defection of Rab29leaded to the damage of PTHR′s retrograde traffickingas well as its stability.Conclusion Rab29which locates in trans-Golgi is indispensable to retrograde trafficking,and it plays a vitalrole in PTHR′s intracellular trafficking.
Key words:Rab29;parathyroid hormone receptor;intracellular trafficking;regulation.
甲状旁腺激素受体（PTHR）参与机体骨与钙代谢，在骨质疏松的发生发展中起着重要的作用[1-3].PTHR的胞内转运机制是目前研究的热点[4].Rab29是一种小G蛋白酶，是70多个Rab蛋白家族的一员，已经被证实在囊泡出芽、融合以及保持包膜细胞器的完整性中发挥重要作用[5-7].本研究通过观察Rab29在细胞内的定位，细胞转入Rab29突变型观察PTHR在细胞内的分布以及基因敲除Rab29观察PTHR的稳定性，从而探讨Rab29对甲状旁腺激素受体胞内转运的调控作用。
1材料与方法。
1.1材料来源。
人Rab29、PTHRcDNA序列由Open Biosys-tems（GE Dharmacon,美国）公司提供；Myc-6磷酸甘露糖受体（MPR）的质粒由Nebraska大学的Richard G.MacDonald教授赠与；pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空载体由本实验室提供；10%胎牛血清由Hyclone（美国）公司提供；Hek293和Hela细胞由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）提供；脂质体Lipofectamine2000由Invitrogen（美国）提供；电化学发光（ECL）试剂由Sigma（美国）提供。
1.2方法。
1.2.1细胞培养与转染 用10%胎牛血清完全培养基，在37℃，5% CO2的培养箱中培养Hek293和Hela细胞。常规PCR突变技术获得Rab29-T21N和Rab29-Q67L突 变，将Rab29的编码区插入pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空载体 中 的KpnⅠ/Xbal区，以获得3xFlag/3xHA-Rab29,将PTHR的编码区插入pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空载中的HindⅢ/Xbal区以获得3xFlag/3xHA-PTHR.转染依照转染试剂说明书将受体质粒与Lipofectamine2000（Invitro-gen,美国）混合，在细胞融合度达到70%~80%时进行。
1.2.2免疫荧光染色成像技术检测 Rab29在细胞内的定位 将HEK293细胞事先种于铺好L-多聚赖氨酸和基质胶的盖玻片上，分别用Golgin97抗体识别高尔基体，EEA1抗体识别内体，Flag抗体识别3Flag-Rab29,在LSM 510共聚焦显微镜（Zeiss,德 国）下进行免疫荧光测定。用蛋白转 运 抑 制 剂（Brefeldin A）处理转染过3Flag-Rab29的Hela细胞5min,在高尔基体完全碎裂后，使用免疫荧光技术，用Flag抗体识别3Flag-Rab29,TGN46抗体识别反式高尔基体，GM130抗体识别顺式高尔基体。
1.2.3免疫荧光染色成像技术检测 Rab29调控逆膜转运通路 研究已经证实MPR是最为经典也是最早发现的逆膜转运中的货物[8].MPR位于高尔基体，负责识别并转运新生成的溶解酶至溶酶体，完成转运后，MPR再经由逆膜转运通路回到高尔基体进行下一轮识别转运[9].在表达Myc-MPR的Hela细胞内分别转染野生型3Flag-Rab29和Rab29的2种突变3Flag-Rab29T21N、3Flag-Rab29Q67L.用免疫荧光技术标记MPR与3种Rab29,在LSM 510共聚焦显微镜下进行免疫荧光测定，观察MPR的细胞内定位。
1.2.4半衰期测定检测 Rab29在PTHR胞内转运的作用 设计蛋白质半衰期试验，在Hek293细胞内转入3HA-PTHR、Rab29siRNA或 者3HA-PTHR、scramble Rab29 siRNA.Rab29siRNA用于敲除Rab29,scramble Rab29siRNA作为阴性对照。在细胞 培养基内孵育放线菌酮 （CHX）和100nMPTH（1-34），分别在0、2、4、6h时收集细胞裂解液，之后采用Western blot技术检测每个时间点的PTHR蛋白水平。
2结果。
2.1 Rab29定位于反式高尔基体 共聚焦显微镜下观察3Flag-Rab29在Hela细胞内成核周聚集分布，并且与高尔基体的标志Golgin97有大量共定位，而与内体的标志EEA1共定位较少，这表明Rab29定位于高尔基体。用Flag抗体识别3Flag-Rab29,TGN46抗体识别反式高尔基体，GM130抗体识别顺式高尔基体。3Flag-Rab29与反式高尔基体开始共同位于细胞核周，并且 有大量共定位，随着高尔基体的整体碎裂，3Flag-Rab29仍然与散在细胞质中的反式高尔基体有大量共定位；反之，3Flag-Rab29与顺式高尔基体开始共同位于细胞核周，并且有大量共定位，随着高尔基体的整体碎裂，3Flag-Rab29几乎不与顺式高尔基体共定位。
2.2 Rab29调控逆膜转运通路 野生型的3Flag-Rab29与MPR有着相似的细胞内分布，均是核周聚集状，并且有着大量的共定位。不论3Flag-Rab29T21N还是3Flag-Rab29Q67L的细胞内定位均由野生型的核周聚集变为细胞内弥散状。这两种Rab29的突变也导致了MPR的细胞内定位发生了改变，即由核周变为弥散，表明Rab29参与调控逆膜转运通路。
2.3 Rab29调控PTHR的胞内分布 PTH（1-34）刺激后的PTHR内吞至细胞内呈现出核周聚集的分布，并且与野生型Rab29大量共定位，由于Rab29定位于反式高尔基体，可以将Rab29看成高尔基体的标志物，所以这表明了内吞进细胞内的PTHR回到了高尔基体。对照组中PTHR的降解速率较缓慢，在6h处，仍有大于60%的PTHR未被降解。当Rab29被敲减掉之后，PTHR的降解速率显着加快，在6h处，PTHR只剩不到40%未被降解。蛋白免疫印迹（Western blot）的灰度分析强有力得证明了Rab29的缺陷导致了PTHR的稳定性下降，降解加速。见图1.
3讨论。
为确定Rab29在细胞内的定位，本研究首先探究了Rab29在细胞器上的分布情况。研究证明Rab家族的蛋白参与了囊泡出芽和融合这些膜转运过程[7,10],因此本研究首先将视野放到Rab29与高尔基体，内体这2个经典膜转运细胞器的关联上。本研究证实了Rab29定位于高尔基体。由于高尔基体由顺式高尔基体（cis-Golgi）和反式高尔基体（trans-Golgi）组成，这两部分在蛋白质的修饰和转运中有这不同的作用。同时，本研究同样使用免疫荧光技术证实了Rab29定位于反式高尔基体。
本研究中使用免疫荧光技术标记MPR与3种Rab29.野生型的3Flag-Rab29与MPR有着相似的细胞内分布，均是核周聚集状，并且有着大量的共定位。不论3Flag-Rab29T21N还是3Flag-Rab29Q67L的细胞内定位均由野生型的核周聚集变为细胞内弥散状。本研究Rab29的突变也导致了MPR的细胞内定位发生了改变，即由核周变为弥散。推测这种改变的原因是Rab29的突变导致了逆膜转运通路受损，MPR不能经由逆膜转运通路从溶酶体回到高尔基体，从而弥散在了细胞内。持续激活型的Rab29Q67L表现出了与无功能型Rab29T21N对MPR相似的影响。其原因可能是Rab29Q67L虽然持续结合ATP,成为激活形式，但是Rab29Q67结合ATP后又迅速将ATP水解掉，所以也表现为无功能型突变形式。
本研究证实了定位于反式高尔基体的Rab29是逆膜转运通路中不可或缺的一部分，并且Rab29调控了PTHR的胞内转运。这于先前的关于逆膜转运体retromer终结PTHR的cAMP的实验相符合，只有当逆膜转运体retromer将PTHR转运至 高 尔 基 体 时，信 号 转 导 才 被 终 止[7,11].Rab29调 控PTHR的意义不仅在于保证PTHR顺利到达高尔基体重新回到细胞膜表面，还在于Rab29增加了PTHR在细胞内的稳定性，阻止了PTHR被溶酶体迅速降解[12].
综上所述，定位于反式高尔基体的Rab29是逆膜转运通路中不可或缺的一部分，对PTHR的胞内转运起着重要的调控作用。继续探究逆膜转运以及PTHR的转运机制，可以丰富对于受体转运的了解，为转运机制缺陷而导致的受体调控骨代谢障碍的疾病找到新的治疗靶点具有重要的临床和科研价值。
参考文献：
[1]Bellido T,Saini V,Pajevic PD.Effects of PTH on osteo-cyte function[J].Bone,2013,54（2）：250-257.
[2]Kang DS,Tian X,Benovic JL.Arrestins and G Protein-Coupled Receptor Trafficking[J].Handb Exp Pharma-col,2014,512（219）：173-186.
[3]Vilardaga JP,Romero G,Friedman PA,et al.Molecularbasis of parathyroid hormone receptor signaling and traf-ficking:a family B GPCR paradigm[J].Cell Mol Life Sci,2011,68（1）：1-13.
[4]Feinstein TN,Wehbi VL,Ardura JA,et al.Retromer ter-minates the generation of cAMP by internalized PTH re-ceptors[J].Nat Chem Biol,2011,7（5）：278-284.
[5]Mitra S,Cheng KW,Mills GB.Rab GTPases implicated ininherited and acquired disorders[J].Semin Cell Dev Biol,2011,22（1）：57-68.
[6]Wang S,Ma Z,Xu X,et al.A role of Rab29in the integri-ty of the trans-Golgi network and retrograde trafficking ofmannose-6-phosphate receptor[J].PLoS One,2014,9（5）：e96242.
[7]Pfeffer SR.Rab GTPase regulation of membrane identity[J].Curr Opin Cell Biol,2013,25（4）：414-419.
[8]Arighi CN,Hartnell LM,Aguilar RC, et al.Role of the mammalian retromer in sorting of thecation-independent mannose 6-phosphate receptor[J].JCell Biol,2004,165（1）：123-133.
[9]Seaman MN.Cargo-selective endosomal sorting for re-trieval to the Golgi requires retromer[J].J Cell Biol,2004,165（1）：111-122.
[10]Onnis A,Finetti F,Patrussi L,et al.The small GTPaseRab29is a common regulator of immune synapse assem-bly and ciliogenesis[J].Cell Death Differ,2015,22（10）：1687-1699.
[11]Attar N,Cullen PJ.The retromer complex[J].Adv En-zyme Regul,2010,50（1）：216-236.
[12]Shenoy SK,Barak LS,Xiao K,et al.Ubiquitination of be-ta-arrestin links seven-transmembrane receptor endocyto-sis and ERK activation[J].J Biol Chem,2007,282（40）：29549-29562.
关键词：Rab29;甲状旁腺激素受体；胞内转运；调控。
Abstract:Objective To explore the intracellular distribution of the Rab29as well as the regulation of the Rab29in the intracel-lular trafficking of parathyroid hormone receptor（PTHR）。Methods By immunofluorescence technique,the intracellular distribu-tion of the Rab29was observed.Wild type Rab29and two mutant-types of Rab29were transfected respectively and the intracellulardistributions of the three types of Rab29were observed using immunofluorescence technique.Co-transfection of PTHR and Rab29was constructed in cells,and then the intracellular distribution of the PTHR which was regulated by Rab29with the help of electronmicroscope after immunofluorescence treatment had been observed.Using half-life experiment,the stability of the PTHR was testedafter Rab29was knocked-down.Results Rab29located in trans-Golgi apparatus,and the wild-type Rab29exhibited perinuclear pat-tern while the mutant-types were dispersed in cells,the defection of Rab29leaded to the damage of PTHR′s retrograde traffickingas well as its stability.Conclusion Rab29which locates in trans-Golgi is indispensable to retrograde trafficking,and it plays a vitalrole in PTHR′s intracellular trafficking.
Key words:Rab29;parathyroid hormone receptor;intracellular trafficking;regulation.
甲状旁腺激素受体（PTHR）参与机体骨与钙代谢，在骨质疏松的发生发展中起着重要的作用[1-3].PTHR的胞内转运机制是目前研究的热点[4].Rab29是一种小G蛋白酶，是70多个Rab蛋白家族的一员，已经被证实在囊泡出芽、融合以及保持包膜细胞器的完整性中发挥重要作用[5-7].本研究通过观察Rab29在细胞内的定位，细胞转入Rab29突变型观察PTHR在细胞内的分布以及基因敲除Rab29观察PTHR的稳定性，从而探讨Rab29对甲状旁腺激素受体胞内转运的调控作用。
1材料与方法。
1.1材料来源。
人Rab29、PTHRcDNA序列由Open Biosys-tems（GE Dharmacon,美国）公司提供；Myc-6磷酸甘露糖受体（MPR）的质粒由Nebraska大学的Richard G.MacDonald教授赠与；pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空载体由本实验室提供；10%胎牛血清由Hyclone（美国）公司提供；Hek293和Hela细胞由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）提供；脂质体Lipofectamine2000由Invitrogen（美国）提供；电化学发光（ECL）试剂由Sigma（美国）提供。
1.2方法。
1.2.1细胞培养与转染 用10%胎牛血清完全培养基，在37℃，5% CO2的培养箱中培养Hek293和Hela细胞。常规PCR突变技术获得Rab29-T21N和Rab29-Q67L突 变，将Rab29的编码区插入pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空载体 中 的KpnⅠ/Xbal区，以获得3xFlag/3xHA-Rab29,将PTHR的编码区插入pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空载中的HindⅢ/Xbal区以获得3xFlag/3xHA-PTHR.转染依照转染试剂说明书将受体质粒与Lipofectamine2000（Invitro-gen,美国）混合，在细胞融合度达到70%~80%时进行。
1.2.2免疫荧光染色成像技术检测 Rab29在细胞内的定位 将HEK293细胞事先种于铺好L-多聚赖氨酸和基质胶的盖玻片上，分别用Golgin97抗体识别高尔基体，EEA1抗体识别内体，Flag抗体识别3Flag-Rab29,在LSM 510共聚焦显微镜（Zeiss,德 国）下进行免疫荧光测定。用蛋白转 运 抑 制 剂（Brefeldin A）处理转染过3Flag-Rab29的Hela细胞5min,在高尔基体完全碎裂后，使用免疫荧光技术，用Flag抗体识别3Flag-Rab29,TGN46抗体识别反式高尔基体，GM130抗体识别顺式高尔基体。
1.2.3免疫荧光染色成像技术检测 Rab29调控逆膜转运通路 研究已经证实MPR是最为经典也是最早发现的逆膜转运中的货物[8].MPR位于高尔基体，负责识别并转运新生成的溶解酶至溶酶体，完成转运后，MPR再经由逆膜转运通路回到高尔基体进行下一轮识别转运[9].在表达Myc-MPR的Hela细胞内分别转染野生型3Flag-Rab29和Rab29的2种突变3Flag-Rab29T21N、3Flag-Rab29Q67L.用免疫荧光技术标记MPR与3种Rab29,在LSM 510共聚焦显微镜下进行免疫荧光测定，观察MPR的细胞内定位。
1.2.4半衰期测定检测 Rab29在PTHR胞内转运的作用 设计蛋白质半衰期试验，在Hek293细胞内转入3HA-PTHR、Rab29siRNA或 者3HA-PTHR、scramble Rab29 siRNA.Rab29siRNA用于敲除Rab29,scramble Rab29siRNA作为阴性对照。在细胞 培养基内孵育放线菌酮 （CHX）和100nMPTH（1-34），分别在0、2、4、6h时收集细胞裂解液，之后采用Western blot技术检测每个时间点的PTHR蛋白水平。
2结果。
2.1 Rab29定位于反式高尔基体 共聚焦显微镜下观察3Flag-Rab29在Hela细胞内成核周聚集分布，并且与高尔基体的标志Golgin97有大量共定位，而与内体的标志EEA1共定位较少，这表明Rab29定位于高尔基体。用Flag抗体识别3Flag-Rab29,TGN46抗体识别反式高尔基体，GM130抗体识别顺式高尔基体。3Flag-Rab29与反式高尔基体开始共同位于细胞核周，并且 有大量共定位，随着高尔基体的整体碎裂，3Flag-Rab29仍然与散在细胞质中的反式高尔基体有大量共定位；反之，3Flag-Rab29与顺式高尔基体开始共同位于细胞核周，并且有大量共定位，随着高尔基体的整体碎裂，3Flag-Rab29几乎不与顺式高尔基体共定位。
2.2 Rab29调控逆膜转运通路 野生型的3Flag-Rab29与MPR有着相似的细胞内分布，均是核周聚集状，并且有着大量的共定位。不论3Flag-Rab29T21N还是3Flag-Rab29Q67L的细胞内定位均由野生型的核周聚集变为细胞内弥散状。这两种Rab29的突变也导致了MPR的细胞内定位发生了改变，即由核周变为弥散，表明Rab29参与调控逆膜转运通路。
2.3 Rab29调控PTHR的胞内分布 PTH（1-34）刺激后的PTHR内吞至细胞内呈现出核周聚集的分布，并且与野生型Rab29大量共定位，由于Rab29定位于反式高尔基体，可以将Rab29看成高尔基体的标志物，所以这表明了内吞进细胞内的PTHR回到了高尔基体。对照组中PTHR的降解速率较缓慢，在6h处，仍有大于60%的PTHR未被降解。当Rab29被敲减掉之后，PTHR的降解速率显着加快，在6h处，PTHR只剩不到40%未被降解。蛋白免疫印迹（Western blot）的灰度分析强有力得证明了Rab29的缺陷导致了PTHR的稳定性下降，降解加速。见图1.
为确定Rab29在细胞内的定位，本研究首先探究了Rab29在细胞器上的分布情况。研究证明Rab家族的蛋白参与了囊泡出芽和融合这些膜转运过程[7,10],因此本研究首先将视野放到Rab29与高尔基体，内体这2个经典膜转运细胞器的关联上。本研究证实了Rab29定位于高尔基体。由于高尔基体由顺式高尔基体（cis-Golgi）和反式高尔基体（trans-Golgi）组成，这两部分在蛋白质的修饰和转运中有这不同的作用。同时，本研究同样使用免疫荧光技术证实了Rab29定位于反式高尔基体。
本研究中使用免疫荧光技术标记MPR与3种Rab29.野生型的3Flag-Rab29与MPR有着相似的细胞内分布，均是核周聚集状，并且有着大量的共定位。不论3Flag-Rab29T21N还是3Flag-Rab29Q67L的细胞内定位均由野生型的核周聚集变为细胞内弥散状。本研究Rab29的突变也导致了MPR的细胞内定位发生了改变，即由核周变为弥散。推测这种改变的原因是Rab29的突变导致了逆膜转运通路受损，MPR不能经由逆膜转运通路从溶酶体回到高尔基体，从而弥散在了细胞内。持续激活型的Rab29Q67L表现出了与无功能型Rab29T21N对MPR相似的影响。其原因可能是Rab29Q67L虽然持续结合ATP,成为激活形式，但是Rab29Q67结合ATP后又迅速将ATP水解掉，所以也表现为无功能型突变形式。
本研究证实了定位于反式高尔基体的Rab29是逆膜转运通路中不可或缺的一部分，并且Rab29调控了PTHR的胞内转运。这于先前的关于逆膜转运体retromer终结PTHR的cAMP的实验相符合，只有当逆膜转运体retromer将PTHR转运至 高 尔 基 体 时，信 号 转 导 才 被 终 止[7,11].Rab29调 控PTHR的意义不仅在于保证PTHR顺利到达高尔基体重新回到细胞膜表面，还在于Rab29增加了PTHR在细胞内的稳定性，阻止了PTHR被溶酶体迅速降解[12].
综上所述，定位于反式高尔基体的Rab29是逆膜转运通路中不可或缺的一部分，对PTHR的胞内转运起着重要的调控作用。继续探究逆膜转运以及PTHR的转运机制，可以丰富对于受体转运的了解，为转运机制缺陷而导致的受体调控骨代谢障碍的疾病找到新的治疗靶点具有重要的临床和科研价值。
参考文献：
[1]Bellido T,Saini V,Pajevic PD.Effects of PTH on osteo-cyte function[J].Bone,2013,54（2）：250-257.
[2]Kang DS,Tian X,Benovic JL.Arrestins and G Protein-Coupled Receptor Trafficking[J].Handb Exp Pharma-col,2014,512（219）：173-186.
[3]Vilardaga JP,Romero G,Friedman PA,et al.Molecularbasis of parathyroid hormone receptor signaling and traf-ficking:a family B GPCR paradigm[J].Cell Mol Life Sci,2011,68（1）：1-13.
[4]Feinstein TN,Wehbi VL,Ardura JA,et al.Retromer ter-minates the generation of cAMP by internalized PTH re-ceptors[J].Nat Chem Biol,2011,7（5）：278-284.
[5]Mitra S,Cheng KW,Mills GB.Rab GTPases implicated ininherited and acquired disorders[J].Semin Cell Dev Biol,2011,22（1）：57-68.
[6]Wang S,Ma Z,Xu X,et al.A role of Rab29in the integri-ty of the trans-Golgi network and retrograde trafficking ofmannose-6-phosphate receptor[J].PLoS One,2014,9（5）：e96242.
[7]Pfeffer SR.Rab GTPase regulation of membrane identity[J].Curr Opin Cell Biol,2013,25（4）：414-419.
[8]Arighi CN,Hartnell LM,Aguilar RC, et al.Role of the mammalian retromer in sorting of thecation-independent mannose 6-phosphate receptor[J].JCell Biol,2004,165（1）：123-133.
[9]Seaman MN.Cargo-selective endosomal sorting for re-trieval to the Golgi requires retromer[J].J Cell Biol,2004,165（1）：111-122.
[10]Onnis A,Finetti F,Patrussi L,et al.The small GTPaseRab29is a common regulator of immune synapse assem-bly and ciliogenesis[J].Cell Death Differ,2015,22（10）：1687-1699.
[11]Attar N,Cullen PJ.The retromer complex[J].Adv En-zyme Regul,2010,50（1）：216-236.
[12]Shenoy SK,Barak LS,Xiao K,et al.Ubiquitination of be-ta-arrestin links seven-transmembrane receptor endocyto-sis and ERK activation[J].J Biol Chem,2007,282（40）：29549-29562.
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