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海岛-大陆分布植物的遗传分化——以岭南山竹子为例

来源:985论文网 添加时间:2020-05-14 11:24
摘要
海岛的面积相对狭小,且由于海水的长期隔绝,加上其独特的生存环境,导致海岛的植物多样性与大陆有较大的差异。因此,海岛是探究生态学、生物地理学、生物进化的理想场所。海南岛位于我国境内且被琼海所隔,形成了独特的海岛景观。岭南山竹子是多年生藤黄属植物,具有丰富的药用价值和经济经济价值,在海南岛及广东地区广泛分布。本文通过cpDNA序列分析技术以及SSR分析标记技术对6个海南岛岭南山竹子种群以及3个大陆岭南山竹子种群共217个样品进行了对比分析。采用Popgene软件,对数据进行分析对比,分析了岭南山竹子的种群遗传多样性水平、遗传结构、遗传分化、以及亲缘关系。同时对海岛和大陆岭南山竹子种群的遗传多样性进行了对比分析,得出的主要结论如下:
(1)本文通过产品DNA序列分析,发现岭南山竹子基因多样指数为0.2156。从99对SSR引物中筛选出13对多态性良好的引物,其中多态性位点115个,多态位点比率为95.78%。通过SSR分析发现岭南山竹子种群基因多样性指数在0.109-0.183之间,香农指数在0.163-0.269之间。以上结果说明岭南山竹子遗传多样性水平较高。
(2)通过cpDNA序列分析发现,岭南山竹子种间遗传分化系数为13.6%,说明遗传分化主要发生在种群内部,分化程度为86.4%,基因流为0.671。SSR分析发现岭南山竹子在种群内部有54.64%的遗传分化,基因流为0.6025。说明岭南山竹子种群间基因交流较少。
(3)通过对9个岭南山竹子种群进行UPGM聚类分析得到,9个岭南山竹子种群分为三大种群,其中XW种群和LZ种群为一类,SW种群和S种群为一类,其余的NW、N、E、NE、SX五个种群为一类。说明,岭南山竹子遗传关系与地理分布有一定的相关性,但并不是唯一因素。
(4)通过cpDNA序列分析进行单倍型网络图分析,发现岭南山竹子种群主要可以分为6个单倍型,分别为Hap1-Hap6,单倍型网络图则是以Hap2为中心呈辐射状散开。实验结果表明,在测试的岭南山竹子中,Hap2为原始的单倍型。且海南岛岭南山竹子可能起源于大陆地区。
(5)通过对比海岛岭南山竹子种群与大陆岭南山竹子种群遗传多样性水平发现:大陆岭南山竹子遗传多样性要略高于海岛岭南山竹子。这可能是由于大陆环境相对开放,种群之间更容易发生基因流动,从而丰富了遗传多样性。
本文通过cpDNA序列分析和SSR分子标记技术,首次对海岛和大陆上共有的岭南山竹子种群的遗传多样性进行了对比分析。以在种群水平上对岭南山竹子在海岛和大陆两种不同生态环境中的遗传多样性、遗传结构、遗传分化等方面的变化,为在隔离生境中植物种群遗传变异及进化规律提供依据和参考。
 
关键词:岭南山竹子;遗传多样性;cpDNA;SSR分子标记
1.前言
1.1海岛植物遗传多样性研究现状
1.1.1海岛与大陆种群遗传多样性的研究现状
与大陆不同,海岛的面积相对狭小,且由于海水的长期隔绝,加上其独特的生存环境,导致海岛的植物多样性与大陆有较大的差异。因此,海岛是探究生态学、生物地理学、生物进化的理想场所,部分海岛已经进化出特有物种,海岛植物种群遗传多样性的研究成为学者们研究的热点。
国内对海岛与大陆种群遗传多样性的研究主要集中在地理隔离、人为活动对物种遗传多样性的影响。理论上海岛由于受到海水的隔离,造成基因流受阻,导致海岛上植物遗传多样性与大陆植物遗传多样性相比较低。冷欣[1]等人的结论与理论相符,她们通过ISSR技术对8个舟山群岛的红楠种群的遗传结构进行了探究,结果发现种群遗传多样性分化较低,但种间遗传分化程度较高,且地理隔离对红棉遗传多样性具有显著影响。马晓英[2]等人基于11个内陆居群和32个岛屿居群的252份标本,采用ISSR分子标记技术对真藓的遗传多样性进行了研究发现:岛屿与内陆居群间的遗传多样性差异显著,岛屿居群间的分化程度(=0.453)大于内陆居群(=0.387),岛屿居群的遗传分化与地理来源间存在极显著相关性(=0.478,=175,<0.001)。地理隔离效应是导致岛屿居群间遗传分化的重要因素。岛内居群间的遗传分化水平较低,仅有29.4%~29.7%的遗传多样性存在于居群间。通过聚类分析发现,43个居群可划分为10大类群,真藓遗传关系受地理因素和生境异质性的影响,水域隔离影响了真藓繁殖体在岛屿间的传播。吴曼等人采用基因芯片分析比较海岛棉和陆地棉种间差异基因的表达,为以后克隆及功能验证纤维发育相关基因提供了重要参考,也为实现分子标记辅助育种与棉花产量和纤维品质性状的遗传改良奠定了基础。
但也有学者发现地海岛与大陆间的地理理隔离对部分物种的遗传多样性影响并不具有显著的差异性。张恒庆[3]等人分别对海岛、大陆藜的遗传多样性特点,以探究地理隔离以及人类的活动对种群遗传多样性的影响。研究发现人类活动影响了藜种群的扩散与更新,从而影响藜种群的物种多样性,而海岛隔离并未对藜种群的遗传多样性造成显著的影响。在他们之后的研究中,探究了不同岛屿上藜种群的遗传多样性以及遗传结构的差异,结构发现不同岛屿藜种群之间具有较高的遗传多样性差异,但种群多样性、种群遗传分化的差异与地理距离并未发现显著的相关性[4]。李灿[5]对海岛与大陆的鹅观草的遗传多样性进行了研究,发现地理隔离与两种鹅观草的种群多样性变化没有相关性。
国外对海岛与东大路种群遗传多样性的研究主要集中在岛屿特有种以及生态保护的研究。Kato[6]等人发现野生大岛樱仅限于伊豆群岛和日本的邻近半岛,在地理分布上受到严格的限制。他们通过叶绿体DNA(cpDNA),扩增的片段长度多态性(AFLP)调查了七个种群的遗传多样性和分化,发现7个野生大岛樱的遗传变异主要集中在中群内,地理距离与种群间的遗传分化有一定的关系。此外,他们发现与相关物种的杂交可能已经影响了该野生樱花的遗传结构,并且可能发生了一些基因渗入。Jordi López-Pujol[7]等人对福门特拉岛(西班牙巴利阿里群岛)特有的多年生百日草(Delphinium pentagynum subsp)进行了研究,发现了该植物存在近亲繁殖的现象,导致了种群的遗传结构发生改变。Richard[8]等人发现岛屿种群比大陆种群更容易灭绝,岛屿特有物种的灭绝率高于非特有物种。他们根据岛屿和相关大陆物种的同工酶和微卫星杂合性,估算了182个非地方性和28个地方性岛屿种群的近交系数,发现岛屿物种近交显着,地方性的近交系数明显高于非地方性岛屿。因此,他们认为近亲繁殖衰退可能是导致岛屿种群灭绝倾向的一个因素。Sabinianae(大锥松)是松属亚种中的三个物种之一。目前仅存在两种松属种群,一种在加利福尼亚南部大陆,另一种在圣罗莎岛上280公里,这些种群在野外和普通的园林种植中都表现出不同的总体形态。 Haller[9]等人发现可根据松节油成分和同工酶分析显示出差异,提供了该物种的遗迹状态的证据。瓜达卢普柏(Callitropsis guadalupensis)是墨西哥瓜达卢佩岛的特有种,是唯一的森林的主要树种。150年前,山羊被引入该岛后,该物种的数量在下降。 Escobar[10]等人比较了比较该岛特有物种与大陆物种的遗传多样性。另外,分子标记的出现促进了利用种群遗传学揭示岛屿系统中的分化和物种形成。在海洋岛屿上的分类单元中看到的一种常见模式是种群内部和种群之间遗传变异的水平降低繁殖系统.[11]等人发现种群数量和世代时间对于海岛植物分化很重要,密切相关的分类单元之间的杂交也很重要。人为干扰通过砍伐森林和引入入侵性动植物影响了植物种群的数量和大小。易位和重新引入是保护或恢复野生物种面临灭绝威胁的物种的重要工具。但是,要了解混合种群的潜在遗传后果,需要了解供体和受体群体内部的遗传变异以及它们之间的相似性。Alacs[12]等人使用两个独立的标记系统(微卫星和AFLP)对一个岛屿和四个小残留的大陆种群Setonix brachyurus进行了遗传多样性测量。Setonix brachyurus是一个受威胁的中型大型荚果,只限于零散的栖息地残留物和澳大利亚西南部的两个离岸岛屿。他们发现,与大陆种群相比,岛上种群的AFLP多样性显着较低。鉴于将岛上的物种与大陆隔离已经有一个已知的时间(6000年前),并且AFLP标记的总体发展速度更为保守,因此这一的结果与数千年前(但小于6,000年)分裂的大陆种群一致。Alacs等人的结果表明,将岛屿物种转移到大陆以补充大陆物种,将会引入遗传上明显分化且可能出现适应不良的个体。
1.1.2海岛与大陆分布植物遗传多样性研究价值
(1)濒危物种的保护
Jordi López-Pujol[7]等的研究发现多年生百日草是福门特拉岛的特有种,且该物种仅有一个种群,这意味着该物种灭绝的风险要远高于其他物种,且该物种还受到放牧、火灾等人为的威胁,导致该种群灭绝的风险进一步提高,建议对该物种建立保护区同时采取保留、储存种子等非就地保护措施,以保证该物种的延续。黄藤属常绿植物(Garcinia paucinervis Chun & F. C. How )仅生长在中国西南部和越南北部海拔在300-800米之间的石灰岩山脉的干燥丛林中,该树是典型的喀斯特地貌特有树种,具有较高的应用价值,广泛的应用于造船、军事工业、优质家具。由于该数目的高经济价值,过度砍伐已经造成该物种的个体迅速减少。喀斯特地貌对于植物种子的扩散、发芽具有不利的影响,导致种群再生能力不足,当种群遭到破坏后,种群更加难以再生。Hu[13]等人为有效保护该物种,并分析该物种的遗传多样性、遗传结构和基因流,他们研发并坚定了来自G.paucinervis中的22个微卫星基因座,这些标记物还可用于评估和分析古希腊芽孢杆菌(G.paucinervis)中的遗传多样性和种群结构,以及评估藤黄属(Garcinia)属中的其他物种(如甘蓝假单胞菌(G. bracteata))的遗传多样性,有助于保护黄腾属植物的遗传多样性。Zhang[14]等人研究了濒危物种藤黄藤的遗传多样性和种群结构,发现该物种近交抑制的风险以及杂合子缺乏可能是由于严重的栖息地破碎化和种群数量减少所致,大多数种群个体之间最近很少有基因交换,他们还发现遗传距离与地理距离无关,表明基因流受到限制,他们建议来自云南省的种群可被分类为独立于其他种群的独立种群,并应将其视为优先保护单位。冷欣[15]等人对我国浙江丹州群岛的岛屿特有种,且被列为浙江省濒危植物的全缘冬青(Ilex integra)进行了探究。结果发现,全缘冬青与其他海岛植物相比,遗传多样性偏低、遗传分化程度较高、岛屿间地理隔离对全缘冬青种群间遗传分化产生了较为显著的影响,她们建议应采取就地保护并收集不同岛屿的全缘冬青进行混合栽培,促进基因交流。
加那利群岛是大西洋的火山群岛,拥有约570种特有物种的丰富植物区系。特有物种约占岛屿原生植物的40%,约20%的特有物种属于国际自然保护联盟的E(濒危)类别。Javier Francisco[16]等人阐述了18个属8个科的69种特有物种的同工酶变异。发现异源酶基因座的平均物种水平遗传多样性为0.186,是太平洋群岛特有物种报道的平均水平的两倍。物种内平均28%的同工酶多样性存在于种群之间,表明种群间的分化水平很高。生殖生物学研究表明。异族物种种群数量的减少将促进双亲近亲繁殖并增加近亲衰退。种群中同工酶多样性的比例相对较高,表明保存物种遗传变异的最有效策略是保护尽可能多的种群。他们指出加那利群岛许多特有物种的遗传多样性多方面的威胁,并针对性的提出了保护建议。Honjo[17]等通过分析了叶绿体DNA的五个非编码区的序列变异,收集了有关物种内种系谱信息以用于日本濒危物种报春草的保护计划。他们发现大多数单倍型的分布在地理上受到限制,但是一种单倍型在日本北部广泛分布,并且在地理上较远的地区发现了几种单倍型。通过对单倍型的系统发育分析揭示了三个主要进化枝。根据分子变异分析,总的cpDNA变异中59.9%存在于区域之间,32.5%存在于区域内的种群中,而7.6%存在于种群中。因此,他们提出如果重视该物种的遗传保护,则应避免在各个地区之间移植。
(2)利于育种培育
植物遗传多样性对新品种的培育具有重要的作用,了解植物的遗传多样性信息,有利于培育出性状优良的植株。海岛棉的品种优良,有利于对杂交育种。陈光[18]等人对海岛棉遗传多样性进行了探究。结果发现SSR分子标记对鉴别海岛棉的品种及遗传多样性具有重要的作用。刘义满[19]等人对茭白遗传多样性和遗传变异进行了分析,发现茭白的遗传变异来自菰黑粉菌的遗传变异,并对茭白育种技术进行了讨论。王中生[20]等人探究了新木姜子的遗传多样性和分化程度,发现新木姜子的遗传多样性偏低,了解其遗传多样性对于该濒危植物的保护具有重要意义,同时选育游廊品系,对该物种的培育具有重要的作用,优良品系可用于海岛植被的恢复。
(3)利于了解物种形成及变化
Koji[21]等人调查了一种来自南韩Ullung岛的地方性物种(Acer okamotoanum)的遗传变异,与其他经历了成枝作用(和适应性辐射)的群体相比对分析。他们对八种多态性微卫星标记的遗传变异进行了检查。他们发现Acer okamotoanum种群F值相对较高,表明在定殖和物种形成过程中遗传漂变很强。另外,他们发现通过生化作用衍生的海洋特有植物的遗传后果将与通过成枝作用衍生的遗传结果有很大不同,这说明最初的创始种群通过在相对统一的环境中积累突变而在时间上分化。当前,由于人类的相互作用,许多物种的种群正在分散和减少。由于遗传漂移,近交和迁徙减少,这些过程将倾向于减少种群内的遗传多样性并减少个体杂合性。保护生物学家需要了解种群数量对遗传多样性的影响,因为这很可能会影响种群的持久能力。White[22]等人在对苏格兰近海岛屿上物种的研究中,发现大多数岛屿在遗传上相互之间以及与大陆高度不同,而且大多数岛屿的遗传多样性都低于大陆物种。在岛屿物种中,平均预期杂合度,平均观察到的杂合度和平均等位基因丰富度与原木岛大小和原木种群大小呈显着正相关。
地理隔离和多倍化是植物进化的核心概念。García-Verdugo[23]等人的研究为群岛的分层组织提供了一个框架,用于测试多倍体分类群和孤立种群的进化结果。通过使用扩增的片段长度多态性和简单的序列重复标记,确定了油橄榄的三个地理隔离级别的遗传多样性和分化模式:大陆-群岛,群岛内的岛屿和岛屿内的种群。在亚种规模上,六倍体 maroccana的遗传多样性要高于岛上的同类。说明地理隔离与高度遗传分化有关。他们还发现加那利群岛的遗传多样性与每个种群发生的地区或岛屿中最后一次火山活动的日期显着相关,但在这种模式在较旧的岛屿(特内里费岛和马德拉群岛)中没有得到证实,这些岛屿的种群在遗传上是同质的。他们发现最年轻的岛屿拉帕尔玛岛(La Palma)的种群之间遗传多样性低,遗传分化显着。
1.1.3海岛植物种群起源
海岛植物的起源可能与其周围岛屿相关。王中生[24]等人通过对丹州群岛新木姜子的遗传多样性分析以及UPGM聚类分析,发现朱家尖岛新木姜子是由人为移入普陀山岛,而普陀山岛的新木姜子则是部分是由大猫岛迁入。冷欣[13]等人对丹州群岛中全缘冬青的研究发现,舟山岛的全缘冬青可能来自桃花岛种群,而朱家尖岛和普陀岛全缘冬青种群之间的亲缘关系则较近。林立[25]等人对中日两国5个岛屿的山茶种群遗传多样性进行了探究。结果通过UPGMA分析,发现日本鹿儿岛的山茶与5个岛屿的亲缘关系最为接近,而浙江朱家尖岛的山茶种群则象山山茶种群亲缘关系较为接近。岭南山竹子在海南的起源可能是在三亚和乐东地区,影响岭南山竹子繁衍路线的因素需要进一步验证。
另外,地质运动对植物种群的迁移也存在影响。canariensis是马卡洛尼亚的一种流行分类群,具有diaspore多态性。 Talavera María[26]利用分子数据和有关diaspore类型的信息,研究了该分类单元在Macaronesia中的起源和定殖途径,他们假设canariensis具有从东部到西部岛屿的殖民化路线,还发生了至少一个从戈梅拉岛到马德拉兰群岛的基因流动事件。他们认为,在殖民化过程中,可分散的水辉石的类型发生了变化,因此最西端岛屿的种群中的可分散性下降。Du[27]等人揭示了地质历史中经历过造山活动的地区的生物多样性,如橡木栎是地方性的,但却在喜马拉雅东部的横断山生物多样性热点地区广泛分布。
迄今为止,大多数研究表明,大陆岛屿直接从邻近大陆接收其生物群。但是,只有很少的研究表明,大陆岛屿上的物种可能起源于其他遥远的非邻近地区。Chen[28]等人使用分布在中国西南和东南大陆,印度支那,海南和台湾群岛的partridges(柏树属)来测试大陆岛上的物种是否可能起源于遥远的地区而不是邻近的大陆。他们发现海南和台湾特有的A. ardens和A. crudigularis的祖先可能起源于印度支那,而不是附近的印度支那。东南大陆。分歧时间估计表明,他们的祖先很可能是在冰河时期使用印度支那,海南和台湾群岛之间长时间暴露的大陆架在海南和台湾群岛定居的,这一点以前没有得到证实。因此,将分布数据与系统发生信息相结合可以为大陆岛屿和周围大陆地区的历史生物地理学提供新的思路。
Inoue[29]等人对伊豆群岛和大陆日本风铃的同工酶变异进行了探究,发现Nei在岛屿之间和大陆种群之间的遗传同一性值分别为0.95和0.97,而岛屿和大陆种群之间的遗传同一性值为0.84,表明岛屿种群是一个独立的物种。岛屿和大陆种群的总遗传变异几乎相同。遗传和地质数据表明,岛上居民的祖先是在一个相对古老的时期就建立在北部岛屿上的,并且逐渐地散布到南部岛屿上。染色体数(2n = 34)和同工酶数表明该物种中的基因重复,这表明它是古老的多倍体。毛棉是夏威夷群岛特有的棉花属的唯一成员,它在形态上不同于其他同倍体棉,并且与它们的系统发育关系尚不确定。Dejoode等人通过叶绿体和核糖体DNA限制性酶切位点的变异来估计毛棉多倍体的系统发育。他们发现,毛棉是其余两种同种多倍体物种的姐妹,即G. barbadense和G.darwinii。基于生物地理学证据和分子数据,他们提出了棉铃虫起源于中美洲祖先的跨洋传播。在异源多倍体中观察到很少的限制性位点变体,表明在多倍体化之后,当前谱系的分化相对较快。
1.1.4海岛与大陆基因流的研究现状
基因流的研究现状主要集中于生境片段化对基因流进和物种遗传多样性变化的影响。郝久程[30]等人对海岛、大陆的玉竹种群进行了研究。结果发现海岛玉竹种群的遗传多样性要高于大陆玉竹种群,说明在隔离的生存条件下,玉竹种群间的基因交流更为频繁。袁娜[31]对6个日本西南部的黄山梅种群进行了研究,发现基因流水平较低,说明该种群处于遗传漂变和基因流平衡作用状态。对金毛耳草进行探究发现,岛屿金毛耳草的种群遗传多样性要比大陆金毛耳草种群的遗传多样性低。另外尽管海岛和大陆的金毛耳草种群都处于遗传飘变和基因流平衡的状态,但遗传飘变对海岛金毛耳草种群影响较大。王莹莹[32]对海岛苔藓植物进行了探究发现,在大岛屿上的苔藓种群更容易受到生境片段化的影响。基因流是维持遗传结构的主要因素,研究发现,大灰藓种群和东亚小金发藓种群分化程度均较低,基因流较高,能够抵抗因遗传漂变而产生的不利影响。种群遗传学理论预测,与保存完好的连续种群相比,零散的植物种群确实表现出更少的遗传多样性,更大的遗传多样性和更高的近交率。Chung[33]等人调查了生境破碎化对韩国南海岸三个岛屿上陆地兰花的遗传多样性和近亲繁殖水平和分布的影响。他们选择了两个案例研究,每个案例研究包含10个零散的和10个连续的(即不受干扰的)种群(总共40个种群和1493个个体)。对于这两个案例研究,已经记录了近200年的碎片化现象。使用九个多态同工酶基因座,比较了两个案例研究中每个个体的连续种群之间的遗传多样性和结构。发现连续的种群比片段化的种群具有更大的等位基因丰富度,零散的种群比连续种群的遗传分化程度高出两到三倍,如果维持目前的中等水平基因流并且没有进一步的片段化发生,能够改善这一情况。
另外,植物种群内部和种群之间的基因扩散(流动或迁移)一直是植物育种者和种子生产者所持续关注的问题。经济上的考虑促使人们对基因流作为距离、育种系统、授粉剂和许多国内植物种植设计的函数进行了研究。Orive[34]等人开发了一种新的最大似然方法,用于根据联合核胞质基因型的数量来估计混合交配植物群体中的单向花粉和种子流。数据可能包括多个未链接的核标记物,这些标记物具有单个母本或父本遗传的细胞质标记物,或者具有通过相反亲本遗传的两个胞质标记物,如许多针叶树种。迁移率估计是基于植物基因流的洲-岛模型下的平衡基因型频率与数据拟合的基础上的。
1.1.5陆桥出现对基因流的影响
人类文明发展对大自然的影响是巨大的。张丽霞[35]等人对沙漠公路两侧的羽毛针禾进行了探究,结果发现3个种群的遗传分化系数和基因流存在显著差异,表明公路阻碍了羽毛针禾种群间的基因流。除此之外,他们发现农田的开垦和水库的修建也能够影响羽毛针禾种群间的基因流。边缘效应能够引起生境片段化,导致种群遗传多样性的的变化。水库大坝的形成、人工陆桥湖泊岛屿则容易导致生境片段化,阻碍种群间的基因流[36]。Su[37]等人于2009-2010年在千岛湖(TIL)的29个陆桥岛上建立了长期监测区,探究物种丰富度,香农指数,植物平均高度,植物平均直径计算了从胸缘到内林的胸高(DBH)和沿边缘-内部梯度的植物密度等群落特征,以研究边缘效应。结果表明:在整个坡度(大于50 m)内,物种丰富度和香农指数受到影响,边缘效应的范围为平均株高20-30 m,植物密度和平均DBH 10 m,边缘梯度之间的社区属性差异很大。物种丰富度和香农指数在中间边缘梯度达到峰值。另外,他们还发现沿边缘到内部梯度,植物密度降低,植物平均高度增加。所有五个群落属性均与边缘梯度显着相关,不同的功能群,常绿或落叶树种,乔木或灌木,耐荫性或耐荫性物种受边缘效应的影响不同。结果表明,边缘效应对零散的森林群落的影响随群落属性和功能群的变化而变化。气候振荡和海平面波动强烈影响了居住在东亚温带温带森林中的物种的谱系差异和种群动态。茹雅璐[38] 等人该地区是否有多个陆桥在这些物种的基因流中发挥作用进行了探究,发现陆桥能够阻碍这些物种的基因流。
1.2海南岛介绍
1.2.1海南岛地质历史
海南岛是中国第二大岛屿,位于中国大陆南端。海南岛地层多呈天窗式出露,仅占全岛面积的18%。海南岛中最古老的底层是中元古界抱板群,主要成为为深水碎屑浊积岩夹镁铁质火山岩,经角闪岩相区域变质作用形成的混合片麻岩、混合岩化片岩夹斜长角闪岩系,组成海南岛的结晶基底,其上为石碌群含铁岩系上覆南华系石灰顶组含冰碛砾岩[39]。由于地质岩石的不同,海南岛土壤性质也具有一定的差异,对不同植物的生长存在一定的影响。研究发现海南岛不同母岩上土壤类型的发育呈现多样性。另外,母岩类型、成土环境、成土年龄等因素的会显著的影响土壤类型的分布,如:在酸性的火成岩上发育的土壤类型主要有雏形土和富铁土,在基性岩上发育的土壤则主要是良好的铁铝土,在碎屑岩上的土壤主要是雏形土,而海相沉积物则由于土壤形成时间的不同出现了多样的土壤类型。尽管成土母岩成分不尽相同,但由于海南岛湿热的气候条件,一些在原生母岩上发育的土壤的土壤性质并不存在显著的差异,如交换性钙、镁、钠等的含量差异并不明星,但也有部分土壤化学性质如交换性钾的含量继承了母岩特性。研究还发现,在自然条件下,在海南岛各种母岩上发育的土壤,大多数并不适宜种植香蕉,但在基性火成岩和海积物上发育的土壤,则更容易受到人为管理措施的影响,如果满足一定的技术和经济投入,海南岛热带作物的种植潜力可以得到进一步的挖掘[40]。
1.2.2海南岛研究价值研究现状
(1)海南岛生态经济价值
随着科技的不断发展,自然生态环境也越来越受到重视。生态系统与生态过程共同形成的人类赖以生存的环境条件即生态系统服务功能。它包括生态调节功能、生态系统产品会文化等等。其中,生态调节功能是对生态环境进行保护或资源开发的基础。欧阳志云等[41]对海南岛生态系统类型进行了划分,将其划分为13类,综合分析了海南岛的生态调节功能,如防风固沙、水土保持等。同时,他们也对海南岛的生态经济价值进行了评估。结果表明,在2002年,海南岛的生态调节功能价值约为2000亿-2150亿。
(2)海南岛的物种保护价值
海南岛物种多样性丰富,很多是海南岛特有种,且数量较少,属于濒危物种,如五唇兰、海南坡鹿、鹦鹉螺、海南长臂猿等,其中,五唇兰在全海岛仅有几百株分布,濒临灭绝。海南岛物种多样性价值不可估量,对海南岛物种多样性进行保护刻不容缓。张路[42]等人将140个海南岛濒危物种作为指示物种,提出了海南岛物种多样性保护区。他们建议扩充尖峰岭保护区群、鹦哥岭-黎母山保护区群、五指山-吊罗山保护区群;新建抱龙林场-林鼻岭-福万岭保护体系;在海南岛北部建立以水源保护为主,同时兼顾珍稀物种保护的水源地保护带。
(3)学术研究价值
海南岛的民族文化一直受到关注,从清末至民国初期,一直有外域学者对海南岛黎族文化进行研究[43]。另外,海南岛是古文化、古墓的发掘地,具有重要的考古研究价值[44]。除此之外,海南岛的气候环境绝佳,适合动植物的生存,经过历史变迁和地壳运动,海南岛具有一定的化石资源,是化石开发,研究动植物进化的重要资源[45]。
1.3岭南山竹子概述
1.3.1岭南山竹子的生物学特征
岭南山竹子(Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.)又称岭南山倒捻子、粘牙仔、海南山竹子等。岭南山竹子属于藤黄科藤黄属乔木或者灌木,树皮呈深灰色,在老枝上能够发现断环纹,成年个体高约5-15m,胸径长约30cm。岭南山竹子叶片呈长圆形,近革质,叶片长度约为5-10cm,叶片宽约2-3.5cm,叶柄长约1cm。岭南山竹子为异株单性花,花小,直径长约3mm,单生或呈聚伞花序,花梗长约3-7mm,花期在4-5月,果期在10-12月。岭南山竹子果实呈圆球形或卵圆形,长约3-3.5cm,可食用。岭南山种子含油量高,约为60%,种仁含油量约为70%[46]。
1.3.2岭南山竹子的生长习性及分布范围
岭南山竹子在平地、丘陵、密林、疏林中都有分布,多生长于海拔200-400 m处。岭南山竹子生活环境温和,气温平均约20-22℃,空气潮湿,喜光,幼龄略耐荫,喜酸性土壤,繁殖能力强。岭南山竹子是热带雨林中常见的树种,常与 火果、牛奶果、木荷、多花山竹子、龙眼等混生[46]。
岭南山竹子分布于我国广东、广西的南部,在海南、越南北部也有分布。岭南山竹子在我国海南琼中、万宁等地区是常见种、优势种。
1.3.3岭南山竹子的研究价值
岭南山竹子的药用价值一直以来是研究关注的重点。岭南山竹子是一种药用植物,它的树皮、树叶和果实均可入药,能够起到消炎止痛、止泻生津、收敛生肌的功效。还具有抗病毒、抗炎、抗癌等作用。因此对胃炎、消化不良、牙周炎、湿疹等疾病具有一定的疗效,还可以用来清洗伤口[47]。
除了药用价值外,岭南山竹子的种子含油量丰富,可用用于工业制油,用于制皂、制备润滑油等。另外,岭南山竹子的树干可用于制作家具、工艺品、器具等。岭南山竹子树皮中含有的单宁可以用于制作栲胶。树皮内层还具有一种黄色素,可以制作颜料。
在广西多地,岭南山竹子被作为果树栽培,或与其他树种制作混交林,形成了独特的园林景观。另外,岭南山竹子作为海南等地的常见种、优势种,对岭南山竹子进行研究有助于了解该地区的遗传多样性,能够合理的开发利用该资源[48]。
1.4岭南山竹子的研究现状
1.4.1化学成分及药理作用研究现状
(1)岭南山竹子的主要化学成分
岭南山竹子可谓全身是宝,在树皮、树枝、树叶、果实中都能够提取到多种化合物,目前已提取出120余种化学成分,可概括为苯甲酮类化合物、三萜类化合物、黄酮类化合物、口山酮类化合物(xanthone,xan)。如下下表所示。其中苯甲酮类化合物、口山酮类化合物是岭南山竹子的主要活性成分,在各个部位均能检测到。
表1.1岭南山竹子化学成分及分布情况
化合物种类 果实(种) 树枝(种) 树皮(种) 树叶(种) 总计
苯甲酮类 6 12 12 21 29
三萜类 0 7 0 0 10
黄酮类 2 5 0 5 9
口山酮类 0 19 19 5 31
苯甲酸类 0 1 0 2 3
甾体类 1 4 0 1 4
联二苯类 0 0 0 4 4
其他 2 19 0 9 30
 
苯甲酮类化合物是滕黄科植物的特征性化合物,也是岭南上竹子的主要活性物质之一。目前,从岭南山竹子中提取的苯甲酮类化合物约30种。苯甲酮类化合物大多是由通过羧基相连的两个苯环构成的,取代基多为羧基、甲氧基、异戊烯基。天然的苯甲酮类化合物具有多种较强的生物活性,包括抗真菌,抗HIV,抗微生物,抗氧化剂,抗病毒和细胞毒性等,具有非常强的应用价值[49]。
口山酮类化合物在黄藤属植物中的分布最为广泛。目前,在岭南山竹子中提取到了约30种口山酮类化合物,大多都具备较好的生物活性。天然的口山酮具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌等作用。
除了苯甲酮和口山酮类,岭南山竹子中含有甾体类化合物,如β-谷甾醇,豆甾醇等。三萜类化合物,如木栓酮、熊果酸等。苯甲酸类化合物,如:苯甲酸、3--甲氧基-4-羟苯甲酸等。黄酮类化合物,如:槲皮素、滑石粉、茉莉黄酮等。这些化合物也具有多种生物活性,如,黄酮类化合物能够抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗肿瘤等等[50]。
(2)岭南山竹子的药理作用
镇痛抗炎作用:郑作文[51]等人发现岭南山竹子具有镇痛作用,能够抑制由二甲苯引起的小鼠耳部肿胀,且岭南山竹子对蛋清引起的大鼠足肿胀有明显的抑制作用。他们还发现岭南山竹子能够明显抑制炎症早期的血管通透性亢进和水肿,能够抑制炎症的发展。上述结果表明,岭南山竹子在治疗烧伤过程中发挥着镇痛和抗炎作用。β-谷甾醇具有镇咳抗炎的作用,在岭南山竹子中发现的β-谷甾醇能够用于临床慢性支气管炎的治疗[52]。
抗菌作用:岭南山竹子能够抑制烧伤创面的常见感染菌,防止烧伤创面感染,对烧伤的治疗具有积极的作用。也有研究表明,岭南山竹子能够促进皮肤细胞的生长,加速创口愈合[53]。廖红等研究结果显示,岭南山竹子粉对烧烫伤创面常见的感染菌(绿脓杆菌、大肠杆菌、金葡菌、白葡菌、沙雷氏菌、肺炎杆菌、变形杆菌、乙型链球菌等)作用12h后,可完全抑菌,揭示了岭南山竹子粉对烧烫伤的疗效[20]。林源等也以此为基础进行的临床试验,再一次印证了岭南山竹子粉促进皮肤细胞生长,加快伤口愈合的能力[21]。由于岭南山竹子中的fukugiside、morelloflavone对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌三种致病菌均有一定的抑制作用,所以很可能这类化合物作为主要活性成分发挥治疗烧烫伤的作用。
抗氧化作用:岭南山竹子中的黄酮类物质能够起到清除自由基的作用,具有较强的抗氧化能力。岭南山竹子提取物能够清除DPPH等自由基,且清除能力与使用浓度成正比[54]。赵李妮等则对岭南山竹子茎皮部分进行了体外抗氧化活性的研究。在对茎皮提取物石油醚段、乙酸乙酯段、水溶性段的抗氧化活性进行评价后,发现3个极性段都有较好的清除ABTS+活性,且清除活性随着浓度增加而增强;而对DPPH自由基的清除活性大于ABTS+自由基[2+]。由此可见,岭南山竹子茎皮提取物中多种化合物都具有较好的抗氧化活。
抗病毒能力:目前,尚无有效的药物可治疗EV71感染。研究发现,一种从藤黄果中分离的活性化合物--扁豆素,以剂量依赖的方式有效抑制了EV71感染,岭南山竹子中的扁豆素是对抗EV71的有效化合物,为治疗和预防手足口病提供了新的策略[55]。
抗癌作用:徐宏喜等通过实验研究发现,岭南山竹子的丙酮提取物对诱导宫颈癌Hela谷3细胞凋亡也有很好的疗效,相比之下甲醇提取物效果较差。由此进一步进行活性追踪测试,从其丙酮提取物中分离得到前文提到的可诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的7个化合物,包括oblongixanthoneC,oblongifolinFoblongifolinG,oblongifolinB,nigrolineaxanthonesT,oblongifolinD。oblongixanthonesA-C和oblongifolinsE二都有对HeLa-C3细胞凋亡的诱导作用,而oblongifolinC是最有效的诱导物,而后又发现blongifolinF和oblongifolinG不仅具显著的促凋亡活性,而且在宫颈癌HeLa细胞中可表现出最好的细胞毒性和caspase3激活,能够有效的杀伤癌细胞[26]。除此之外,garcinoneE对所癌细胞及其他胃癌细胞等具有潜在的细胞毒作用。甾豆醇可作为合成性激素、肾上腺皮质激素、茈体避孕药、更年期病治疗药、利药、抗肿瘤药、同化激素肥激素等多种药物的母体化合物。乙酰齐墩果酸体外抗肿瘤实验表明,其对肺癌NCT-H460细胞有较好活性。生育三烯能够明显抑制人结肠癌SW620细胞、乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HepG2细胞的生长并诱导其凋亡[32],抗氧化,降固醇[33]。此外还可以用来预防和治疗乳腺癌。cambogin对Daoy MB髓母细胞瘤[34]、小鼠P388白血病细胞都有很好的抑制作用;griffipavixanthone在进行体外研究后,发现其对人类非小细胞癌(NSCLC)增殖的抑制能力。可通过casp酶和线粒体功能导致细胞凋亡[36],这些化合物都有望成为治疗癌症的新药物。
抗糖尿病作用
Trinh近期实验发现,岭南山竹子中提出的多种化合物可在体外通过对&glucosidase和PTP1B的抑制来实现其抗糖的作用,其中化合物norcowanin,在抗糖药的发展上有广阔的景。
1.4.2栽培繁殖现状
黄少锋[56]等人探讨了岭南山竹子的育苗技术,并对其容器苗营养土配置、出土移植等进行了概述。岭南山竹子的育苗过程最好是先在沙床上催芽,待种子发芽后移入容器中培养,育种容器多为塑料薄膜袋。在苗床的制做需要经过铲草、翻土、碎土和除杂后便可筑畦状床。为防地下害虫为害,可先用20克/升呋喃丹溶液,再用0.3%的马拉硫磷溶液或2毫升/升的敌百虫溶液淋洒床基及其四周。播种时种子采用沙藏分层催芽,条播育苗。当芽苗长出2-3片真叶时,可移苗上杯,起苗时注意保持小苗根系完整,移入容器时防止弯根、浅植和“吊颈”等情况。做到即移即植,及时淋水,移苗应按苗木从大到小分批移植。另外岭南山竹子山地造林应选在山腰以下较深厚肥沃的土壤,水湿条件也较好。造林前一般采用块状整地。宜用穴植造林。对于混交林,应及时将影响岭南山竹子生长的其它树种进行修枝,以防过度遮荫。Mad[48]对山竹子的无性繁殖方法进行了探究,发现嵌木芽接的成功率最高,劈接和刈裂腹接的成功率几乎相等,贴皮芽接的成功率较低。
1.4.3岭南山竹子遗传多样性研究现状
遗传多样性与种群对外界环境的适应能力紧密相关,遗传多样性越高,对环境的适应能力越强。刘子金[57]等人对9个岭南山竹子种群的59个个体的遗传多样性和亲缘关系进行了分析,发现9个岭南山竹子种群遗传多样性丰富、遗传变异和生物进化的几率高,可以作为育种的优质资源。另外,他们发现在研究的岭南山竹子种群中,无论是种群间还是种群内部,都能够发现显著的遗传分化。基因流能够反应种群遗传结构。他们发现调查的岭南山竹子种群基因流较小,基因流动不大,导致基因流不足以消除种群中的遗传飘变引起的种群分化。另外,刘子金和杨小波[58]等人对包括岭南山竹子在内的10种滕黄科植物遗传多样性进行了分析,发现滕黄科植物之间具有丰富的遗传多样性,能够对环境有较好的适应能力。
1.5 SSR分子标记技术概述
1.5.1 SSR分子标记技术原理
SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记技术也称作微卫星DNA标记(Microsatellite DNA)。微卫星DNA最早于1974年被 Skinner等发现。1988年,Jefrey等人将其发展为新的遗传标记系统。1989年,Litt等人将其名为为“Microsatellite”,即SSR技术[59]。
在真核生物的基因组中,每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大。因此,能够形成其座位的多态性。研究发现,每个SSR座位两端有一段保守的DNA序列,可以根据此保守序列设计引物,利用 PCR技术进行扩增,然后用高浓度琼脂糖凝胶或变性聚丙稀酰胺凝胶电泳进行分析。由于SSR多态性是由简单序列重复次数的差异引起的,因此在扩增的PCR带上会出现小片段或不连续的带 J。由此可见,SSR分子标记的基本原理就是要了解SSR座位两侧的核苷酸序列,寻找其中的特异保护区[60]。SSR技术扩增基因组DNA,能够揭示同一物种的不同个体间微卫星位点间的信息变化,也呈现出遗传多样性高的特点,该技术采用较长的引物进行扩增,与模板的结合程度较高,避免了错配情况的出现,使得扩增具有较强的专一性,同时也提高了实验结果的可重复性。
1.5.2 SSR分子标记技术试验流程
SSR分子标记技术主要包括DNA的提取、引物设计、PCR扩增、电泳染色及统计分析等。
(1)DNA的提取
DNA的提取可采用 CTAB法或常规的酚/氯仿提取。提取完毕的DNA样品保存在4℃或-20℃用于SSR分析。目前,研究发现用改进的CTAB法提取的DNA的片段大且完整,且无RNA污染或者讲解,能够很好的保持DNA的结构,并能成功地进行 SSR扩增,可以考虑CTAB法代替原有的酚/氯仿法提取用于SSR分析的DNA[61]。
(2)引物设计
SSR标记分析的关键在于必须设计出一对特异的PCR引物,这一步将会直接影响PCR扩增结果。开发SSR引物序列首先要建立DNA文库,筛选鉴定微卫星DNA克隆,然后测定这些克隆的侧翼序列,最后根据SSR两侧序列在同一物种内高度保守的特性设计引物。引物的设计长度一般在15~30个碱基之间,但不可超过38个碱基;引物序列中的GC含量对反应过程的退火温度起决定作用,其含量一般维持在 40 ~ 60%之间。在这一过程中,了解SSR座位两侧的核苷酸序列,寻找其中的特异保守区是重点所在。另外,从数据库或已发表的有关文献中查询,使用亲缘关系比较接近 的其他物种的引物也是获得所需引物的有效途径。目前,一般的实验室都是利用 现成的商业化的SSR引物进行PCR扩增的[62]。 
(3)PCR扩增
在确定了引物的基础上就可以在PCR仪上对基因组中的SSR序列进行扩增。由于不同引物、不同材料的扩增条件存在着差异,这就需要对引物浓度、Tag酶、Mg浓度、pH值、变性温度、退火温度等进行优化,以便获得清晰、准确的图谱[63]。
(4)电泳染色及统计分析
PCR产物需经电泳分离、染色显示后才能进行谱带观察、统计。用于分离琼脂糖凝胶电泳的类型可以分为垂直型和水平型两种,前者由于制胶简单,加样方便,可操作性强等优点而更受欢迎。电泳系统对温度的要求不是很高,但是对浓度的要求比较严格 ,SSR电泳琼脂糖浓度一般在1.5-2.0%之间,聚丙烯酰胺常用浓 度为6%.然后使用硝酸银(AgNO3)或溴化乙啶(EB)进行染色,在紫外光下即可成像观察,根据电泳结果,记录不同物种在同一位点上的条带有无情况。只记录能够稳定存在于重复实验中的位点,有带的记为“1”,无带的记为 “0”,不确定的记为“.”。将每个植物种群的SSR-PCR 扩增结果都转换成由“1、0、.”组成的三元矩阵,最后形成数据库,使用相关的计算机软件如 POPGENE、NTSYS 等进行数据统计分析[64]。
1.5.3 SSR分子标记技术的应用
(1)SSR技术在作物遗传多样性研究中的应用 
分子标记既能检测种内的遗传多样性,也可以对种间的遗传多样性进行比较。近年来,SSR分子标记已被应用于玉米、小麦、大豆、水稻等作物物种遗传多样性 的研究并在这些领域取得了一定的成绩。杨勇[66]等利用SSR标记研究了30份我国主要糯玉米的遗传变异,结果表明,30个糯玉米自交系可以分为Ⅶ大类群,自交系之间遗传距离范围为 0.0000-0.8204,说明糯玉米间的遗传多样性较高。梅铭凤[67]等用EST-SSR和SSR标记研究了野生一粒小麦和野生二粒小麦种质的遗传距离,他们认为不同来源的二粒小麦的A基因组可能有不同的起源。
(2)构建遗传连锁图谱
SSR分子标记以其独特的优点成为构建高饱和度连锁图的有力工具。1999年, Cregan[68]等将3种不同群体构建的3个大豆遗传图谱整合成1张含有20个连锁群的大豆图谱,共有 1423个标记,其中SSR标记606。随后,赵姝华[69]等采用SSR分子标记构建了包含10个连锁群体,104个SSR分子标记,总长度为1656cm的高粱连锁图谱。2006年,张帆[70]等利用159对多态性SSR引物构建了长度为 1775.75cm的玉米遗传连锁图谱。这些都有力地证明了SSR分子标记技术在构建遗传连锁图谱中的作用 。 
(3)分子标记辅助选择
分子标记辅助较传统的育种方式有育种周期短、不受外界条件干扰等优点 ,因而能够达到事半功倍的效果。SSR分子标记技术在作物回交育种、杂种优势利用中都有很显著的作用,尤其是在作物抗性育种方面已经取得了一定的成绩。李仕贵[71]等应用与稻瘟病抗性基因Pe-d(t)紧密连锁的SSR分子标 RM262对含有该抗病基因的品种稻谷与感病品种江南香糯和8987的F群体进行MAS选择,结果发现应用该标记的抗性纯合和杂合带型选择抗性植株的准确率可达98%以上。
1.6研究目的及意义及创新点
1.6.1研究的目的及意义
研究目的:海岛由于长期受到海水的隔绝,形成了一个相对封闭的环境,基因交流局限在海岛范围内,可能导致其种群遗传多样性、遗传分化、遗传变异形成独特的特点。本文以海岛和大陆共有的的岭南山竹子为研究对象,来探究地理隔离对物种遗传多样性的影响。
研究意义:本文通过对岭南山竹子的遗传多样性分布探究,为海岛-大陆的遗传分化的特点进行了补充,揭示了地理隔离对植物种群多样性的影响。通过cpDNA序列分析和SSR分子标记技术,首次对海岛和大陆上共有的岭南山竹子种群的遗传多样性进行了对比分析。以在种群水平上对岭南山竹子在海岛和大陆两种不同生态环境中的遗传多样性、遗传结构、遗传分化等方面的变化,为在隔离生境中植物种群遗传变异及进化规律提供依据和参考
1.6.2研究的创新点
部分学者以海岛种群作为研究海岛植物种群多样性的材料。但其研究的对象多为海岛特有种、濒危种,得到的结论并不能够得到普遍认可,本研究选用大陆与海岛之间普遍分布的物种--岭南山竹子,研究结果对于分析地理隔离与物种遗传多样性的影响具有代表意义。研究结果可以为岛屿隔离中存在的一些争议进行科学合理的解释,为以后类似的研究提供可行性的研究方法。另外,目前对于岭南上竹子的研究主要集中在其化学成分及其药理作用方面,对于岭南山竹子遗传多样性的研究较少,本文的研究有助于丰富这一部分内容。另外,本文对海岛-大陆岭南山竹子叶绿体变化进行了探究,这是其他研究者并未涉及的部分,具有一定的新颖性,为其他研究提供了新的研究方向。
 
2.实验材料及方法
2.1实验材料
2.1.1实验仪器
本文中使用的仪器如下表所示。
表2.1实验仪器
仪器名称 型号及厂家
立式高压灭菌器 上海博讯 YXQ-LS-50SⅡ型
冷冻离心机 美国 IEC MicRo,MaxRF
PCR 仪 英国 TECHNE TC-512T-512
琼脂糖凝胶电泳系统 北京六一 DYCP-33A
稳流稳压电泳仪 南京新校园生物技术研究所 DY620s
凝胶成像系统 美国 InGenius LHR
恒温水浴箱 江苏金坛医疗器械厂 HH-W型
微量加样器 Pipet-lite SL-2
快速混匀器 江苏金坛医疗仪器厂 SK-1型
冰箱 海尔 BCD-229KB
冰柜 海尔 BC/BD-272GS
研钵、研杵 上海新诺仪器设备有限公司
 
2.1.2实验试剂
本文使用的试剂如下表所示。
表2.2实验试剂
试剂名称 生产厂家
CTAB 北京索莱宝生物科技有限公司
Tris 北京索莱宝生物科技有限公司
NaCl Sigma公司
EDTA Sigma公司
PVP Sigma公司
硼酸 北京索莱宝生物科技有限公司
溴酚蓝 北京索莱宝生物科技有限公司
甘油 Sigma公司
异戊醇 北京化工厂
氯仿 北京化工厂
液氮 北京化工厂
无水乙醇 北京化工厂
β-巯基乙醇 北京索莱宝生物科技有限公司
DNA Marker 北京中科瑞泰生物科技有限公司
Taq DNA聚合酶 北京中科瑞泰生物科技有限公司
2x PCRmix 北京中科瑞泰生物科技有限公司
 
试剂配制:
 
CTAB溶液:
CTAB 6.057g
Tris 40.908g
NaCl 3.655g
PVP 10g
将上述试剂用蒸馏水溶解,并定容至500ml。
 
10xTBE溶液:
硼酸 27.5g
EDTA 3.9725g
Tris 54g
将上述试剂用蒸馏水溶解,并定容至500ml,备用。使用时按TBE与蒸馏水1:9稀释至1x。
 
10xTE溶液:
Tris 6.0565g
EDTA 1.46125g
将上述试剂用蒸馏水溶解,并定容至500ml,备用。使用时按TE与蒸馏水1:9稀释至1x。
 
6×loading Buffer:
EDTA 0.8765g
溴酚兰 0.05g
甘油 36g
将上述试剂用蒸馏水溶解,并定容至100ml。
 
CI溶液:
异戊醇与氯仿按 1:24混合均匀。
 
2.1.3实验材料
本文共采集9个岭南山竹子天然种群的217个样品用于研究。取新鲜、健康的叶片,采集个体间距约为10 m,采集时间为5-6月。详细信息如表2.3所示。地理位置信息如图2.1所示。
表2.3 岭南上竹子采集信息
种群编号 采集地 样品数量 经度 纬度
NW 临高 21 109.69 19.91
SE 琼中 35 110.02 18.48
E 琼海 17 110.46 19.25
S 儋州 32 109.31 18.14
N 海口 24 110.35 20.02
NE 文昌 24 110.72 19.61
SX 曲界 21 109.03 19.25
XW 徐闻 23 109.17 18.73
LZ 雷州 20 109.83 19.05
 
 
Fig 2.1 岭南山竹子种群分布图
2.2实验方法
2.2.1 岭南山竹子总DNA的提取(CTAB法)
(1)灭菌:将提取岭南山竹子基因组DNA所需仪器、耗材等进行高温高压灭菌,灭菌后取出,降至室温,备用。主要包括:研钵、研杵、离心管(2ml)、移液枪头等。
(2)预先在2ml离心管上做好标记,并向其加入1.2mlCTAB缓冲液,将离心管置于水浴锅中,65℃预热。
(3)取出岭南山竹子样品,并取150-200mg的嫩叶放入研钵中,之后向研钵中缓慢倒入液氮至研钵1/3处,缓慢研磨,待液氮即将挥发完全时,快速研磨,将叶片研至粉末状为宜。依次将岭南上竹子样品按照此步骤研磨,在此过程中,注意避免冻伤。
(4)待样品磨好后,向已经预热好的CTAB溶液中加入20μL的β-巯基乙醇,依次取适量岭南山竹子样品,分别加入到对应的离心管中,充分震荡混匀,放于水浴锅中,65℃孵育30 min。每隔5 min缓慢颠倒混匀,使其充分反应。
(5)取出离心管,室温冷却,待其温度降至室温后,向离心管中加入等体积的CI溶液。将离心管置于垂直混匀器中,缓慢颠倒1h,使CI溶液与提取液充分接触,充分反应。
(6)4℃离心机预冷,将离心管置于离心机中,10000 rpm离心10 min。
(7)取出离心管,尽量避免摇晃,将上清液转移至新的已经做好标记的离心管中。向混合液中再次加入CI溶液,进行二次处理。重复步骤(5)、(6)。
(8)再次将上清液转移到新的离心管中,向其中加入预冷的无水乙醇至2ml,充分颠倒混匀后于4℃静置20 min。
(9)4℃离心机预冷,将离心管置于离心机中,10000 rpm离心5 min。
离心管中沉淀即为岭南山竹子DNA,将离心管中的上清液倒掉,过程中避免将沉淀倒出。向离心管内加入75%乙醇,轻轻晃动,移去75%乙醇,重复2-3次,将离心管置于室温中,待管中液体挥发,沉淀自然风干。
(11)24h后,向DNA中加入400,μL的TE溶液,将DNA充分溶解,置于4℃冰箱中保存,备用。
2.2.2岭南山竹子DNA的纯化
(1) 向DNA溶液中加入1×TE溶液至1mL。 
(2) 向管内加入CI溶液至满管,缓慢颠倒混匀2.5h,使离心管内的提取液与CI溶液充分接触。 
(3) 将混匀后的离心管放入预冷至4℃的冷冻离心机中,10000 rpm离心15 min,慢取出离心管,小心吸取上清液分装至另外两只对应编号的1.5 ml离心管中。 
(4) 在离心管中加入4℃预冷的无水乙醇,将1.5 ml 离心管加满,充分颠倒混匀后放于4℃冰箱中静置20 min。 
(5) 取出离心管,放入预冷至4℃的冷冻离心机中,10000 rpm离心5min。 
(6) 倒掉上清液,加入1mL 浓度为 75%的乙醇,将沉淀弹起,充分漂洗2次后,放入预冷至4℃的冷冻离心机中10000 rpm 离心5 min。 
(7) 倒掉上清液,将离心管放于室温条件下自然风干。24 h后将管内的DNA沉淀直接放入-20℃冰柜中干样保存,另一只对应编号的离心管加入200 ml TE使用液将DNA充分溶解,然后放于4℃冰箱中保存备用。
2.2.3岭南山竹子DNA浓度测定
(1)制胶。配制1×TBE溶液作为电泳缓冲液,取适量1×TBE溶液倒入电泳槽中待用,然后制作浓度为0.8%的琼脂糖凝胶(含有染色剂 EB),待其冷凝后拔出梳子放入电泳槽中待用。 
(2)点样。在封口膜上点3μL的6×Loading Buffer和5μL经过纯化后的岭南山竹子DNA溶液,混匀后点入凝胶上样孔中。 
(3)在上样孔中点入5μL的DNA Marker,以其作为标准分子量进行电泳,开始时将电压调至120V使提取到的岭南山竹子基因组DNA快速出孔,然后下调至 100V的稳定电压。
(4)待溴酚蓝指示剂跑至胶板的一半时,取出胶平板放置于紫外凝胶成像系统中显像并照相保存。 
(5)计算,利用Gel Pro1.1软件,以DNA Marker条带的最大分子量作为标准,通过软件计算出各玉竹DNA原液的浓度。 
(6)根据计算出的分子量,用双蒸水将各岭南山竹子DNA原液稀释成统一浓度,最后将稀释后的溶液再次进行电泳检测稀释结果,稀释后的各玉竹DNA溶液将用于SSR-PCR反应过程。
2.2.4岭南山竹子种群数据统计与分析
(1)数据统计
SSR 标记数据分析:
①根据分子量大小对扩增电泳图读带,以二倍体形式记录,从大到小依次记为 A,B,C…。 
②应用 POPGENE 1.31(Yeh et al.,1999)软件对各居群在多基因座位上的Hardy-Weinberg 平衡进行检测,计算观测等位基因数(Na)、有效等位基因(Ne)、 
多态性位点比率(P)、Nei’s 基因多样性指数(Nei’s)、Shannon’s 信息指数(I)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Nei’s 标准遗传距离(GD)和遗传一致度(GI)。 
③使用软件 GenAlEx 6.502(Peakall and Smouse,2006)进行分子差异分析(AMOVA)和 Mantel 检验。AMOVA 用于检验遗传变异的来源以及居群间分化系数(Fst)及基因流(Nem);Mantel 检验用于检测群体间的遗传距离与其地理距离是否存在相关性。 
④使用 STRUCTURE 2.3.4进行群体遗传结构分析。 STRUCTURE 软件利用贝叶斯方法,通过聚类来推测样品的来源,进而确定居群的遗传结构。
cpDNA 单倍型数据分析:
①利用Clustal X将测序得到的accD-psaI和trnL-trnF两段基因间隔区序列进行排列比对。人工对序列校对之后将序列导入软件 MEGA 5,将比对好的序列保存为FASTA 格式用于以后的序列分析。将序列中的插入和缺失处理为一次突变,即将序列补齐后改变一个碱基。序列初步处理完成后利用软件 DnaSP v5.1生成岭南山竹子cpDNA 单倍型,同时计算每个群体的单倍型数目(N)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(π)。 
②使用软件 DnaSP v5.1 计算两种不同的单倍型分化指数Nst和Gst,Nst是基于单倍型频率和遗传距离分析居群遗传分化,而Gst是在整个居群水平上的遗传分化系数。若 Nst 显著大于 Gst,则表明居群间存在亲缘地理结构。利用DnaSP 5. 1 软件对所有群体进行 Tajima's、Fu 的中性检验,以及对所有群体的动态扩张进行错配分布分析。 
③使用软件 TCS 1.21(Clement et al.,2000)构建单倍型网络图。在单倍型网络图的基础上,使用软件 GEODIS 2.6(Posada et al.,2000)对单倍型进行巢式支系分析(Nested Clade Analysis, NCA),然后利用检索表查询(http://darwin.uvigo. es/software/geodis.html)进而推断岭南山竹子居群经历的动态历史事件。 
④使用 GenAlEx 6.502 软件进行分子差异分析(AMOVA)和 Mantel 检验。
 
3.实验结果及分析
3.1叶绿体引物筛选
叶绿体 DNA(Chloroplast DNA,cpDNA)存在于叶绿体基质中,大多数植物的cpDNA为双链共价闭合环状 DNA,大小约为120-200 kb,cpDNA 细胞里是一个独立的遗传系统,由100多个基因和蛋白亚基组成。由于cpDNA具有多拷贝、分子量小和结构简单的特点,有利于对叶绿体基因组进行分析。另外cpDNA相当保守,不同于线粒体基因组频繁的发生重排,且与核基因组含有较多的重复序列,加之为母系遗传方式,使其具有独立的进化路线只依靠cpDNA的相关数据即可构建系统发育树,如UPGMA、NJ树,能够为遗传信息的多样性提供可靠、准确的信息,适用于生物进化、生物遗传多样性的研究。因此本文以岭南山竹子叶绿体基因组DNA为模板,对海岛、大陆岭南山竹子遗传多样性进行了研究。引物序列是影响PCR反应的关键。首先,我们对合成的组叶绿体引物进行了筛选,本文以cpDNA 非编码区片段:psbA - trnH, trnL - trnF, trnK - matk,psbI - psbK和accD - psaI:进行引物筛选,发现trnL - trnF 和accD - psaI在居群水平上体现出高变异位点,将其作为本研究的最终引物。
表3.1 叶绿体引物序列
序号 引物序列 TM(℃)
trnL - trnF F:TTATTCGATCCAATCGTACCAC 54
R:AGAAGCCATTGCAATTGCCGGAAA
accD - psaI F:GGTTCAAGTCCCTCTATCCC 52
R:ATTTGAACTGGTGACACGAG
 
3.2 cpDNA群体分析
3.2.1cpDNA分析海岛与大陆岭南山竹子的遗传多样性
(1)cpDNA单倍型分析
对实验测定的岭南山竹子的单倍型及其分布进行了分析,通过 Network 软件构建的单倍型网络图,实验结果如表3.2、图3.1及图3.2所示。根据实验结果可以发现测试的岭南山竹子种群主要可以分为6个单倍型,分别为Hap1-Hap6,单倍型网络图则是以Hap2为中心呈辐射状散开。实验结果表明,在测试的岭南山竹子中,Hap2为原始的单倍型。Hap2与单倍型Hap3、单倍型Hap4仅有一个碱基位点的差异,说明Hap2与Hap3、Hap4的亲缘关系较为接近。而Hap2与Hap1之间相差两个碱基位点,亲缘关系也较为接近。Hap2与Hap5之间的碱基位点差异较大,有34个碱基位点的差异,说明Hap2与Hap5之间的亲缘关系最为疏远,Hap5的进化能力最强。而Hap5与Hap6之间的碱基位点差异较小,仅有4个差异,说明Hap5与Hap6间的亲缘关系较为接近,而Hap6位于网络图的最末端,说明其与Hap2的亲缘关系最为疏远,进化能力最强。
表3.2 岭南山竹子cpDNA单倍型分布
种群编号 样品数量 单倍型
NW 21 Hap4
SE 35 Hap3
E 17 Hap1
S 32 Hap1
N 24 Hap2
NE 24 Hap5
SX 21 Hap6
XW 23 Hap2
LZ 20 Hap2
 
 
Fig 3.1 cpDNA 单倍型 TCS 网络图
注:“─”表示代表碱基位点差异个数。 
 
Fig 3.2 cpDNA单倍型分布图
(2)聚类分析
基于cpDNA序列,使用NTsys软件进行UPGMA聚类分析,分析结果如图3.3所示。其中XW和LZ种群为一类,S种群和SW种群为一类,NE种群和SX种群为一类,NW和N种群为一类。
 
Fig3.2 基于cpDNA序列的UPGM分析
(3)遗传多样性分析
为了探究岭南山竹子cpDNA遗传多样性的变化,本文测定了岭南山竹子cpDNA序列的单倍体多样性以及核酸多样性,实验结果见表3.3和3.4。结果显示,岭南山竹子单倍体多样性在0.514-0.713之间,平均为0.637。核酸多样性在0.0014-0.0041之间,平均值为0.00306。说明所测定的岭南山竹子种群间的遗传多样性较为丰富,核苷酸多样性存在着较大差异,其中SE种群的核酸多样性最大。NW种群21个样品中含有10个单倍型,单倍体多样性水平最高。另外,岭南山竹子种群的遗传多样性平均值为0.2156,说明岭南山竹子的遗传多样性丰富。其中,种群内部的遗传多样性平均值为0.1025。无论是种群内部还是种群间岭南山竹子的遗传多样性都较为丰富。这有利于岭南山竹子的变异、进化,以及优质种质资源的保护。
表3.3岭南山竹子cpDNA序列的单倍体多样性及核算多样性
种群编号 样品数量 单倍型 单倍型多样性(h) 核酸多样性(Dij)
NW 21 10 0.713 0.0024
SE 35 10 0.623 0.0041
E 17 4 0.595 0.0026
S 32 9 0.678 0.0035
N 24 6 0.564 0.0041
NE 24 4 0.702 0.0033
SX 21 5 0.664 0.0028
XW 23 3 0.591 0.0037
LZ 20 3 0.605 0.0021
总计/均值 217 54 0.637 0.00306
 
(3)遗传结构分析
本文通过对岭南山竹子种群cpDNA序列分子变异分析(AMOVA)法对岭南山竹子种群遗传结构及分化程度进行了探究,实验结果见表3.4及表3.5所示。实验结果表明,在测试的岭南山竹子中种群内的遗传变异率仅有13.6%,而大部分的遗传变异都处于种群内部,种群内部的变异率高达84.4%。说明岭南山竹子的遗传变异主要存在于种群内部,且变异程度极显著。另外,本文还发现岭南山竹子种群间遗传分化系数为0.136,代表在测试的岭南山竹子种群间有13.6%发生遗传分化,而种群内部的遗传分化为86.4%,说明岭南山竹子种群的遗传分化主要发生在种群内部。这与岭南山竹子种群变异主要发生在种群内部的结论是相互吻合的。
表3.5基于cpDNA序列分析的种群岭南山竹子的遗传分化系数
指标 遗传多样性 种群内遗传多样性 遗传分化系数 基因流
Ht Hs Gst Nm
平均值 0.2156 0.1025 0.136 0.671
标准差 0.0266 0.0107
 
表3.5 基于cpDNA序列的岭南山竹子种群的分子变异分析(AMOVA)
变异来源 自由度d.f. 变异组分 变异百分率% 概率值P
种群间 8 0.039 13.6 0.01
种群内 216 0.248 84.4 0.01
 
3.2.2cpDNA分析海岛与大陆岭南山竹子的基因流
基因流是指生物个体从其发生地分散出去而导致不同种群之间基因交流的过程,可发生在同种或不同种的生物种群之间。基因流的强弱和程度因不同的种或种群、不同的时间和地点而有很大差异,但其基本作用是消弱种群间的遗传差异。一般而言,邻近种群基因频率相似并不一定就是基因流产生的融合作用,也许是选择压力相同造成的;而邻近种群间基因频率出现较大差异,也不能说不存在基因流,这时自然选择的作用超过了基因流,于是种群在强大的选择压力下,即使存在一定的基因流,还是发生了较大的遗传分化。对植物种群而言,即使通过基因流实现了新基因的输入,但由于生殖上的障碍(生殖隔离等),这种基因流并不能得以遗传。
本文通过cpDNA序列对岭南山竹子种群的基因流进行了分析,实验结果见表3.6所示。结果显示:岭南山竹子基因流在0.4762-0.8301之间,平均值在0.671,该数值小于1,说明岭南山竹子之间基因流动不强,其中种群C和种群NW之间基因流动最低,种群E和种群S之间的基因流动最强。这可能是由地理位置之间的距离导致的。另外,人际活动,以及陆桥、大坝等修建,也会导致种群间基因流动发生变化。
表3.6基于cpDNA序列分析岭南山种群基因流
种群编号 NW SE E S N NE SX XW LZ
NW ****
SE 0.5615 ****
E 0.6756 0.7542 ****
S 0.7762 0.5462 0.8301 ****
N 0.7892 0.5781 0.6713 0.6675 ****
NE 0.7645 0.6841 0.5796 0.7861 0.8564 ****
SX 0.6754 0.8021 0.5679 0.7651 0.54863 0.7248 ****
XW 0.7654 0.8624 0.7765 0.6717 0.654 0.5672 0.5468 ****
LZ 0.4762 0.7633 0.6753 0.66675 0.6831 0.6596 0.7215 0.6017 ****
 
3.3 SSR引物筛选
3.3.1引物设计及筛选
引物的设计与筛选是SSR技术关键,影响到后续的扩增,直接影响到实验结果。因此,本文从岭南山竹子基因库中通过数据过滤、拼接数据、相似性聚类、MIS检测,最后使用Primer 3设计了99对SSR引物。
对99对引物进行筛选发现,其中13对引物呈现多态性,选取这13对引物用于本次实验。引物详细信息见表3.2及图3.2。
 
Fig3.2 SSR长度分布统计图
注:横轴是重复单元长度以及具体的重复类型,纵轴是 SSR 数量。
表3.2 SSR引物序列信息
序号 Primer序列(5'-3') 重复序列 TM(℃) 扩增位点 多态位点 多态位点比率(%)
4 F: ACCGATTTTTAACGTGTTATCTGT TTA 56 9 9 100
R: ACAAGCAGTGTGGGATAACTTTG
7 F: ACTTTCTCAATGAACTAGACATTCCA AAC 60 11 11 100
R: GTGCTAGGATCCATATAGCCGAC
L5 F: GGAGATTTCTACTTCGGCATTGC GTT 56 5 5 100
R: TCAAGCGTGGACATCTCGATAAA
L9 F: TCGAGTAGCTAAAGTGAAAACAGC TTTA 56 5 5 100
R: CCATGATTCCCCAAAGCATCAAT
L15 F: GTTGCTAAATTCGCTGCTGTACA AT 56 15 15 100
R: ATCAAATGATGCAACTATCCACA
L23 F: TGTCATCGACCTCAACATAGTTG GAT 56 6 6 100
R: TGATGATCTTGGGTCCTCTATGC
L28 F: AGAATCCATATAGCCGACCACAT TTG 56 5 5 100
R: ACTTTAATTTGAGTGGTGTGAACAC
S15 F: ACAGTTGGTTTTGTTTTCCTCGT AAT 58 11 11 100
R: TCCCCGTCTTTCTCTACCTTGAT
S22 F: CGTCCACACATTTCATTTTTCACA ACAT 58 10 10 100
R: TCAACTAAGACGTTTGATCAAGGC
S66 F: TTTAGGGTCCAACAAACCGATCA AAAT 56 7 7 100
R: GAGCCGTTCTTTGTCTATGCTTC
C1 F: CCCATGACTCTATGTGCTGCTAT AT 56 11 11 100
R: TGGGTAAAGTTGTGGACTATAGCT
C7 F: ACAAAGAACCGAATGTGGAGACT TG 56 14 14 100
R: ACCCTGATGAGAGGAAATTCATCC
C15 F: CTCGTCTCCTTGACACTAACGAT TA 56 22 22 100
R: GGTGAGATACAAGTTAAGATGATGGG
 
3.3.2SSR引物扩增验证
在13对引物中随机选取1对,并进行SSR扩增,电泳条带如图3.3所示。
 
图3.3 S22引物的部分SSR扩增结果
根据结果可以发现,S22引物在实验所测的全部岭南山竹子种群中均能扩增出清晰的条带,条带数量约为2-4条,引物多态性良好,可用于实验。
3.4 SSR群体分析
3.4.1SSR分析海岛与大陆岭南山竹子的遗传多样性
(1)海岛与大陆岭南山竹子的遗传多样性
本文使用Popgene软件对岭南山竹子种群的遗传多样性进行了分析,包括Nei指数和香农指数等,具体信息如表3.3所示。结果显示岭南山竹子的等位基因数在1.31-1.48间,有效等位基因数在1.186-1.3235间,多态百分比在31-48 %间,香农指数在0.163-0.269之间,基因多样性指数在0.109-0.183之间。表明岭南山竹子的遗传多样性较为丰富,其中S种群的遗传多样性要较其他种群丰富,遗传多样性最低的则是NW种群,这两个种群皆为海岛上生长的种群,说明海岛岭南山种群遗传多样性差异较大。相对来说,大陆的岭南山竹子的遗传多样性则较为平均另外实验结果表明,海岛岭南山竹子基因多样性指数为0.141、香农指数为0.211,而大陆岭南山竹子的基因多样性指数为0.162、香农指数为0.214。这样的结果说明,大陆南岭山竹子的遗传多样性要高于海岛,但这并不是普遍的,个别海岛岭南山竹子的遗传多样性要高于大陆岭南山竹子,部分海岛岭南山竹子的遗传多样性与大陆岭南山竹子持平。从整体上看,无论是大陆还是海岛的岭南山竹子遗传多样性都比较丰富,有利于遗传变异和进化,是良好的种质资源。
表3.3不同种群岭南山竹子的遗传多样性
种群编号 等位基因数 有效等位基因数 基因多样性指数 香农指数 多态位点百分率
NW 1.350 1.1972 0.117 0.176 35%
SE 1.450 1.2588 0.151 0.228 45%
E 1.430 1.2522 0.149 0.224 43%
S 1.480 1.3235 0.183 0.269 48%
N 1.310 1.1860 0.109 0.163 31%
NE 1.410 1.2309 0.135 0.205 41%
average 1.405 1.2414 0.141 0.211 40.5%
SX 1.450 1.2883 0.165 0.245 45%
XW 1.450 1.2868 0.164 0.243 45%
LZ 1.440 1.2671 0.158 0.236 44%
average 1.447 1.2807 0.162 0.241 44.7%
 
(2)海岛与大陆岭南山竹子的遗传分化
为探究海岛、大陆岭南山竹子的遗传分化,本文使用Popgene软件对岭南山竹子遗传分化系数进行了分析和AMOVA分析,结果如表3.4和3.5所示。实验所测定的岭南山竹子种群间遗传多样性系数平均为0.2704,其中种群内遗传多样性平均为0.1478,无论是种群间还是种群内部,遗传多样性丰富。遗传分化系数为0.4536,说明种群间的遗传变异占45.36 %,而54.64 %的遗传变异发生在种群内部,说明岭南山竹子的遗传变异主要集中在种群内部。另外,根据AMOVA分析的结果可以发现,岭南山竹子的遗传分化无论是在种群内部还是在种群间都是显著的,这与Popgene的结果相一致。AMOVA结果表明岭南山种群间的遗传变异为42%,种群内的变异为58%,与Popgene分析的结果接近,证明该结论的可靠性。另外,SSR分析得到的结论与cpDNA序列分析得到的结论是一致的。
表3.4不同种群岭南山竹子的遗传分化系数
指标 遗传多样性
Ht 种群内遗传多样性
Hs 遗传分化系数
Gst 基因流
Nm
平均值 0.2704 0.1478 0.4536 0.6025
标准差 0.0295 0.0107
 
表3.5 不同种群岭南山竹子的分子方差分析(AMOVA)
变异来源 自由度
Df 平方和
SS 方差
MS 变异大小 R2 概率
P
种群间 8 425.618 53.202 6.711 42 0.01
种群内 208 466.382 9.328 9.328 58 0.01
总和 216 892 100
 
(3)遗传距离与遗传分化
在证明岭南山竹子不同种群间和种群内部的遗传分化系数后,为了进一步说明岭南山竹子各种群间的分化程度,本文使用Popgene软件对不同种群的岭南山竹子进行了种群间遗传距离的与遗传相似度进行了分析,结果如表3.6所示。发现种群间的遗传距离为0.022-0.1192间,遗传相似度在0.887-0.9782之间。由表3.6可以发现,种群N和种群C之间的遗传距离为0.1192,遗传距离最大,种群C和种群S的遗传距离为0.022,遗传距离最小,遗传相似度最高的是种群C和种群SE,种群间相似度最小的是种群S和种群SE。
  表3.6 岭南山竹子种群遗传距离与遗传一致度
种群编号 NW E SW S N NE SX XW LZ
NW **** 0.9134 0.9329 0.9731 0.9141 0.9498 0.9588 0.9533 0.9549
E 0.0906 **** 0.9317 0.9168 0.887 0.9327 0.9191 0.9247 0.9327
SW 0.0695 0.0707 **** 0.9399 0.9662 0.9695 0.9456 0.9556 0.9474
S 0.0272 0.0869 0.062 **** 0.9377 0.9587 0.9703 0.8876 0.9541
N 0.0898 0.1199 0.0679 0.0643 **** 0.9303 0.9246 0.9168 0.9343
NE 0.0515 0.0697 0.031 0.0421 0.0723 **** 0.9668 0.9639 0.9718
SX 0.0421 0.0844 0.0559 0.0302 0.0784 0.0337 **** 0.9702 0.9664
XW 0.0478 0.0782 0.0454 0.047 0.0869 0.0368 0.0303 **** 0.9782
LZ 0.0462 0.0696 0.054 0.022 0.1192 0.0286 0.0343 0.0342 ****
 
(4)聚类分析
在分析出各个种群间的相似度后,使用NTsys软件进行UPGMA聚类分析,分析结果如图3.3所示。以0.84为阈值,可将岭南山竹子种群分为三大种群,其中XW种群和LZ种群为一大类,SW种群和S种群为一类,其余的NW、N、E、NE、SX五个种群为一大类,其中NW和N种群又可分为一类、NE和W种群又可分为一类。这一结果与cpDNA序列分析结果一致。
 
Fig 3.3岭南山竹子种群的UPGMA聚类分析
3.4.2SSR分析海岛与大陆岭南山竹子的基因流
本文对岭南山竹子种群间的基因流进行了分析,分析结果见表3.4。基因流大小的判断以1为主,若分析数值大于1,则基因交流强,若数值小于1,则表示种群间的基因交流较少,对遗传漂变的抵御能力差,种群易发生变异。岭南山竹子种群间的基因流为0.6025,该数值小于1,说明实验检测的岭南山竹子间的基因交流频率较低,对遗传变异的抵抗能力较差,种群间易发生遗传变异,这与岭南山竹子的遗传变异率高的结果相一致。
 
4. 总结及讨论
4.1海南岛与大陆岭南山竹子的遗传多样性
遗传多样性一般是指种内的遗传多样性,即种内个体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和。遗传多样性是生物多样性的重要组成部分。一方面,任何一个物种都具有其独特的基因库和遗传组织形式,物种的多样性也就显示了基因遗传的多样性。另一方面,物种是构成生物群落进而组成生态系统的基本单元。生态系统多样性离不开物种的多样性,也就离不开不同物种所具有的遗传多样性。因此遗传多样性是生态系统多样性和物种多样性的基础。 一个种群的遗传多样性,决定了这个种群对环境变化的适应能力,一个种群或物种遗传多样性越高或遗传变异越丰富,对环境变化的适应能力就越强越,是一个种群或物种生存能力的潜在体现。
本文比较了大陆地区广东地带的岭南山竹子与海南岛上的岭南山柱子的遗传多样性,以探究大陆、海岛植物遗传多样性是否存在差异。通过cpDNA序列分析,以及SSR分子标记对海南岛和大陆的岭南山竹子遗传多样性进行了探究。结果发现,无论是海岛还是大陆的岭南山竹子,遗传多样性都比较丰富,对环境变化的适应能力都比较强。其中,遗传多样性最高以及最低的岭南山竹子种群都在海南岛上,分别为S种群、NW种群。另外,大陆南岭山竹子的遗传多样性均值为0.162、,海岛岭南山竹子遗传多样性的平均值为,0.141,大陆岭南山竹子的遗传多样性要显著高于海岛岭南山竹子(P<0.05),侧面反映了大陆植物的遗传多样性要高于海岛植物,这与大多数的理论是一致的。造成这种遗传多样性变化的因素有很多。地理距离与隔离是一个重要的因素,海岛由于长期被海水隔绝,导致风媒、动物授粉等途径受阻,基因交流范围有限,难以与大陆的植物进行基因交流。而大陆岭南山竹子基因的流动性相对来说就较大,导致遗传多样性增加,从而导致海岛、大陆岭南山竹子的遗传多样性存在差异。另外,在人类活动较高的区域,遗传多样性较为丰富,如公园等。这可能是由于人类活动增加了岭南山竹子种群间的基因交流,这不但是导致海岛、大陆岭南山竹子遗传多样性差异的原因,也可能是导致海岛上不同地区,岭南山竹子遗传多样性差异的主要原因。
另外,本文通过cpDNA序列分子和SSR分子标记分析对海岛、大陆岭南山竹子的遗传分化特点进行了探究,发现无论是海岛还是大陆岭南山竹子的遗传分化都是显著的,岭南山竹子的遗传变异、遗传分化主要是发生在种群内部,但在种群间也有少部分的遗传分化和变异。
4.2海南岛与大陆岭南山竹子的基因流和陆桥的关系
在群体遗传学上,基因流(也称基因迁移)是指从一个物种的一个种群向另一个种群引入新的遗传物质,从而改变群体“基因库”的组成。通过基因交流向群体中引入新的等位基因,是遗传变异一个非常重要的来源,影响群体遗传多样性,产生新的性状组合。一些个体从一个群体迁移到另一个群体就会把基因带到新的群体,从而产生基因流动。基因流越大,群体间的相似性越大,会导致群体间基因频率和基因型频率呈现哈迪-温伯格平衡,即在一个随机交配的大群体中,没有突变、选择等外界环境因素的影响,基因频率和基因型频率世代恒定。自然选择和遗传漂变会使群体之间的差异增加,而基因流的作用是“弱化”群体间的遗传差异,群体之间趋于一致。
对于一个与大陆相连的岛屿,由于陆地上种群足够大,岛屿比较小,基因流向应该是从陆地到岛屿,即使存在部分个体由岛屿到陆地,这种微弱的基因流并不能改变陆地上群体的基因型频率,可以忽略。而对于海南岛这样被海水与大陆隔绝的海岛来说,基因交流程度较低,基因流较小,对遗传飘变的抵抗能力较弱,这与本文的结论是一致的。
尽管,陆桥的出现增进了海南岛和大陆的交流和人口流动,但短期内难以影响种群间基因流变化。另外,陆桥的出现破坏了周围植物的生态环境,能够产生生境片断化效应,也就是由于人为或自然原因使得原来大面积连续分布的生境变成空间上相对隔离的小生境的现象。在生境片断化后,植物种群的遗传变异程度将降低,而残留小种群间的遗传分化程度将升高。
陆桥的出现导致,岭南山竹子的基因交流发生障碍,阻碍了基因流,促进岭南山竹子种间的遗传分化。通过对cpDNA序列分析发现岭南山竹子的基因流为0.671,小于1,而岭南山竹子种间的遗传分化程度为86.4%,说明陆桥的出现能够阻碍岭南山竹子种群间的基因交流。
4.3海南岛岭南山竹子种群的起源方式
本文对海岛大陆岭南山竹子种群的起源方式进行了探究。通过UPGMA聚类分析,将亲缘关系相近的岭南山竹子进行了归类。以0.84为阈值,可将岭南山竹子种群分为三大种群,其中XW种群和LZ种群为一大类,SW种群和S种群为一类,其余的NW、N、E、NE、SX五个种群为一大类,其中NW和N种群又可分为一类、NE和W种群又可分为一类。
另外,本位还对岭南山竹子的单倍型及其分布进行了分析,通过 Network 软件构建的单倍型网络图。根据实验结果可以发现测试的岭南山竹子种群主要可以分为6个单倍型,分别为Hap1-Hap6,单倍型网络图则是以Hap2为中心呈辐射状散开,说明Hap2在测试的岭南山竹子中,Hap2为原始的单倍型,可能是岭南山竹子的起源中心。Hap2与单倍型Hap3、单倍型Hap4仅有一个碱基位点的差异,说明Hap2与Hap3、Hap4的亲缘关系较为接近。而Hap2与Hap1之间相差两个碱基位点,亲缘关系也较为接近。Hap2与Hap5之间的碱基位点差异较大,有34个碱基位点的差异,说明Hap2与Hap5之间的亲缘关系最为疏远,Hap5的进化能力最强。而Hap5与Hap6之间的碱基位点差异较小,仅有4个差异,说明Hap5与Hap6间的亲缘关系较为接近,而Hap6位于网络图的最末端,说明其与Hap2的亲缘关系最为疏远,进化能力最强。
根据实验结果可以发现Hap2单倍型的种群主要分布在LZ、XW、N等地,LZ和WX是广东省大陆地,N为海南岛临近广东省的城市。从地理位置上可以推测,海南岛上的岭南山竹子肯能是由大陆起源而来,而在海南岛上由于不同的生活环境而逐渐发生变异,亲缘关系逐渐疏远,最终形成了独特的种群。
 
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